NK细胞杀伤活性检测兼

1、1会计学NK细胞杀伤活性检测兼细胞杀伤活性检测兼实验原理实验原理 效应细胞效应细胞 靶细胞靶细胞 释放释放LDH 丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐硝基氯化四氮唑蓝硝基氯化四氮唑蓝实验步骤实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备靶细胞的制备效效-靶细胞相互作用靶细胞相互作用酶促反应酶促反应结果判读结果判读 取培养取培养2448hr的靶细胞的靶细胞(K562), 洗涤洗涤3次（次（1000rpm10min）, 最后最后用完全用完全RPMI-1640培养液调整细

2、胞浓培养液调整细胞浓度至度至1105/ml, 备用。备用。靶细胞的制备：靶细胞的制备：效应细胞的制备效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）（分离外周血单个核细胞）采集静脉血采集静脉血4 ml，加，加0.2ml肝素溶液（肝素溶液（125-250U/ml）抗凝）抗凝分别吸取分别吸取2ml淋巴细胞分层液置淋巴细胞分层液置10ml离心管中，离心管中，将管倾斜将管倾斜45，沿管壁缓缓注入抗凝血，沿管壁缓缓注入抗凝血离心离心2000rpm20min密度梯度离心分离淋巴细胞亚群密度梯度离心分离淋巴细胞亚群用完全用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入（加入0.2

3、ml完全完全RPMI-1640 ，混匀，混匀，1x 107）将所得将所得PBMC用用5倍体积的倍体积的1640洗涤一次洗涤一次2000rpm10 min用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）效效-靶细胞作用靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入加入96孔细胞培养板的孔中孔细胞培养板的孔中, 每份标本设每份标本设2个复孔个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞

4、靶细胞+0.1ml RPMI-1640液液)最大释放对照组最大释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml1NP-40液液), 1000r/min, 2min后后, 置置37、5CO2温箱温箱中孵育中孵育2-4h。A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组实验组 自然释放组自然释放组 最大释放组最大释放组 1 2 3 4 5 6 效应细胞（效应细胞（100l） + + - - - -靶细胞（靶细胞（100l） + + + + + +RPMI1640 （100l） - - + + - - 1%NP-40 （100l） - - - - + + 酶促反应酶促反应置置37预温

5、预温10min, 加入新鲜配制的底物溶液加入新鲜配制的底物溶液0.1ml, 37避光反应避光反应1015min。终止酶促反应终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴（用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸柠檬酸30l）A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12结果计算结果计算 用酶标检测仪在用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔波长下读取各孔OD值值, 并计算并计算NK细胞活性。细胞活性。实验组实验组OD值值-自然释放对照组自然释放对照组OD值值NK细胞活性（细胞活性（%）最大释放对照组最大释放对照组OD值值-自然释放对照组自然释放对照组OD值值=100%1、无论采用何种试验方法、无论采用何种

6、试验方法, 靶细胞的质量是影响细靶细胞的质量是影响细 胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因 素。一般要求靶细胞的自然释放率素。一般要求靶细胞的自然释放率10。2、分离、分离PBMC时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白 层，切勿搅动各层。层，切勿搅动各层。3、吸取细胞培养上清时、吸取细胞培养上清时, 应尽可能不吸动沉淀的细应尽可能不吸动沉淀的细 胞。胞。4、用此法测得、用此法测得NK活性的正常值范围在活性的正常值范围在10-40%。注意事项注意事项:1.1. 记录记录NKNK细胞杀伤实验的原理、方法、细胞杀伤实验的原理、方法、

7、结果。结果。E E花环形成试验花环形成试验【目的要求】【目的要求】1.1.掌握掌握T T淋巴细胞淋巴细胞E E花环试验的原理、正常值，花环试验的原理、正常值， 了解其方法和用途。了解其方法和用途。2.2.熟悉光镜下熟悉光镜下E E花环的形态和计数方法。花环的形态和计数方法。【实验原理】【实验原理】 T T细胞表面具有能与绵羊红细胞（细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBCSRBC）表面糖肽结合的受体，称为表面糖肽结合的受体，称为E E受体受体（CD2CD2）。）。已已证实证实E E受体是人类受体是人类T T细胞所特有的表面标志。当细胞所特有的表面标志。当T T细胞与细胞与SRBCSRBC混合后，混

8、合后，SRBCSRBC便粘附于便粘附于T T细胞表面，细胞表面，呈现花环状。通过花环形成检查呈现花环状。通过花环形成检查T T细胞的方法，细胞的方法，称为称为E E花环形成试验花环形成试验。根据花环形成的多少，可测知根据花环形成的多少，可测知T T细胞的数目，细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。疾病的预后，考核药物疗效等。 【实验方法】【实验方法】淋巴细胞与淋巴细胞与SRBC按一定比例按一定比例(1:10)混合混合 37 5分钟，分钟， 420分钟分钟 取样涂片取样涂片瑞氏瑞氏染色、镜检。染色、镜检。 计数计数E花

9、环数，算出总花环形成率。花环数，算出总花环形成率。 正常值为正常值为60%80%。 花环形成细胞花环形成细胞花环形成细胞花环形成细胞 + + 不形成花环细不形成花环细胞胞100%花环形成细胞花环形成细胞 效效-靶细胞作用靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入加入96孔细胞培养板的孔中孔细胞培养板的孔中, 每份标本设每份标本设2个复孔个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml RPMI-1640液液)最大释放对照组最大释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml1NP-40液液), 1000r/min, 2min后后, 置置37、5CO2温箱温箱中孵育中孵育2-4h。E E花环形成试验花环形成试验【目的要求】【目的要求】1.1.掌握掌握T T淋巴细胞淋巴细胞E E花环试验的原理、正常值，花环试验的原理、正常值， 了解其方法和用途。了解其方法和用途。2.2.熟悉光镜下熟悉光镜下E E花环的形态和计数方法。花环的形态和计数方法。根据花环形成的多少，可测知根据花环形成的多少，可测知T T细胞的数目，细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效