细胞因子对实验性自身免疫性肌炎淋巴细胞B7表达的影响

1、细胞因子对实验性自身免疫性肌炎淋巴细胞B7表达的影响 作者：陶唯宜肖波彭永杨欢李静谢光洁 【关键词】 细胞因子 【摘要】 目的 探讨B7在实验性自身免疫性肌炎（EAM）发病中的作用及干扰素（IFN-）、肿瘤坏死因子（TNF-）、白细胞介素-10（IL-10）、IL-12对其的影响。方法用兔肌肉匀浆免疫小鼠建立EAM模型，观察动物发病情况及肌肉病理改变。取小鼠外周血和脾淋巴细胞进行细胞培养并用细胞因子处理，分别应用流式细胞计和逆转录聚合酶链反应（PCR）检测外周血和脾淋巴细胞B7-1，B7-2蛋白和mRNA的表达及细胞因子对其影响。结果 EAM小鼠外周血和脾淋巴细胞上B7-1、B7-2蛋白的表达

2、明显增强，B7-1、B7-2mRNA的表达与蛋白表达的增加相平行。IFN-、TNF-、IL-12使上述表达明显增强，IL-10则抑制其表达。结论 B7表达与EAM的发病密切相关，细胞因子IFN-、TNF-、IL-10、IL-12可能通过调节EAM小鼠淋巴细胞B7表达而影响EAM的转归。 关键词 细胞因子 B7分子 EAM RT-PCR 流式细胞计【Abstract】 Objective To study the effects of IFN-，TNF-，IL-10and IL-12on the B7mRNA and protein expression of lymphocyte in exp

3、erimental autoimmune myositis（EAM）.Methods FACS and RT-PCR tech2 / 8niques were used to assay the expression of B7in EAM lymphocytes and effects of cytokines.Results IFN-，TNF-andIL-12increased the expression of B7，but IL-10inhibited all the expressions.Conclusion IFN-，TNF-，IL-10and IL-12effected the

4、 B7expression in EAM lymphocytes.Key words cytokine B7 EAM RT-PCR flow cytometry 实验性自身免疫性肌炎（EAM）是一种人工诱导类似人类多发性肌炎（PM）的动物模型，其病理改变与PM基本一致，即肌纤维的坏死和炎性细胞浸润。已有的研究表明PM发病与T细胞的异常活化有关 1，2 。T细胞的活化需要第一信号和第二信号参与，第二信号又称协同刺激信号，主要由T细胞上表达的CD28/CTLA-4与抗原递呈细胞（APC）表面的配体B7相互作用所提供 3 。本实验着重观察B7在EAM中的表达以及IL-10、IL-12、IFN-、TN

5、F-对其影响，试从T细胞活化的角度探讨PM的发病机制。1 材料与方法1.1 材料 PE标记的抗B7-1、B7-2单克隆抗体购自美国Pharmingen公司，IL-10、IL-12、rIFN-、rTNF-、RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒购自美国Promega公司，B7-1、B7-2、-actin引物由中科院上海细胞生物研究所合成，弗氏完全佐剂（CFA）及其它免疫试剂购自北京邦定生物公司。 1.2 方法1.2.1 动物模型和分组 健康雄性昆明小鼠40只（68周，2530g）由湖南医科大学实验动物中心提供。随机分为肌炎组10只（EAM），对照组10只（0.9%NS）。取兔肌肉 基金项目:国家自然科学

6、基金资助项目（编号:39870909）匀浆0.1ml加等量CFA混匀制成0.2ml抗原乳剂注入EAM组小鼠颈部肌肉和皮下组织，1周后重复诱导1次;对照组用生理盐水取代兔肌肉匀浆加等量CFA混匀注射。发病动物症状体征分级标准见文献 4 。两组动物分别于免疫后22天或濒死前，用3%异戊巴比妥钠0.2ml注入小鼠腹腔，麻醉后用无菌注射器于心脏采血，肝素抗凝，同时取脾脏备检。另取大腿肌肉置于10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片做HE染色，行光镜检查。1.2.2 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2蛋白表达 外周血淋巴细胞分离方法见文献 5。脾脏经200目钢网过筛，用Ficoll液分离淋巴细胞，Hanks

7、液洗2次，重悬于含10%小牛血清的1640培养液中备用。淋巴细胞分为细胞因子处理组和未处理组，分别置于96孔细胞培养板中，在37、5%CO 2 中孵育72h。内加5g/ml ConA诱导，培养基中含45%DMEM、10%FCS、10mM HEPES、50g/ml青霉素/链霉素;处理组在上述培养基分别加入100U/ml rIFN-、250U/ml rTNF-、10g/ml IL-10、20g/ml IL-12刺激，在培养后24、48、72h取细胞因子处理组和未处理组淋巴细胞1×10 7 个，分别加B7-1和B7-2单抗1g，置4孵育30min，4000rpm×5min，取沉淀

8、加PBS洗2次，4000rpm×5min，沉淀加0.5ml PBS及20l戊二醛固定液，流式细胞计检测淋巴细胞上B7-1和B7-2蛋白的表达。1.2.3 外周血和脾淋巴细胞B7-1、B7-2mRNA表达水平1.2.3.1 cDNA合成和PCR扩增 取细胞因子处理组和未处理组培养的淋巴细胞1×10 7 个，采用异硫氰酸胍法提取RNA。取样品RNA0.2g，加Oligo（dT）引物1l（100ng/l），5×反转录缓冲液4l，955min，冷却后加入Rnasin20U、2.5mM dNTP4l、AMV转录酶5U，总反应体积20l，42反应60min，然后943min灭

9、活AMV酶，置-20冰箱保存。取cDNA反应液10l，置0.5ml Eppendorf管中，分别加入2.5mM dNTP4l，Taq酶1U，10×PCR缓冲液5l，-actin上、 下游引物各1l（10pmol/l），B7-1或B7-2上下游引物各2l（10pmol/l），引物序列见表1，加去离子双蒸水至终体积50l，再用50l石蜡油覆盖，95变性5min，反应条件为95变性1min，55退火1min，72延伸1min，循环30次后72延伸5min。表1 B7-1、B7-2、-actin引物序列1.2.3.2 PCR产物的分析 20l PCR扩增产物在含有0.5g/l溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，时间1h，电