哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表达及意义

1、哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表达及意义 作者：陈德忠, 付国昊, 朱述阳, 吕丽丽 赵传云【摘要】 目的: 观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织CCR3及EOS不同时相表达的变化, 探讨哮喘发病的可能机制。方法: 用卵白蛋白(OVA)和生理盐水致敏法制备豚鼠哮喘和对照模型, 分为正常对照组（N）及哮喘组（A、 B、 C、 D、 E）, 每组8只, 于激发后30 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h处死, 瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例, 免疫组织化学技术检测骨髓中CCR3及CD34蛋白的表达; 制备豚鼠肺组织病理标本, 苏木精伊红染色, 免疫组化检测肺组织中CC

2、R3和CD34的表达。结果: (1)哮喘组骨髓和外周CCR3与CD34及EOS表达明显增加; (2)OVA激发后, 骨髓和外周CCR3、 CD34及EOS表达: 30 min变化不明显（肺内CD34表达增加）, 6 h（肺内CD34表达下降）、 12 h达到峰值, 24 h开始下降, 48 h恢复正常水平; (3)骨髓的变化早于外周, CCR3的表达高峰早于CD34表达与EOS的增多高峰, 且CCR3、 CD34和EOS互呈线性相关（肺组织内除外）。结论: 哮喘豚鼠肺组织和骨髓之间存在骨髓CD34祖细胞、 EOS细胞到循环再到肺组织的通路, 骨髓和肺组织CCR3表达增强, 为CD34细胞、 E

3、OS从骨髓快速募集到肺组织提供了可能。 【关键词】 支气管哮喘; CCR3; CD34; 骨髓; 豚鼠2 / 17 哮喘是多种细胞（如嗜酸粒细胞、 肥大细胞、 淋巴细胞、 中性粒细胞和气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道炎症性疾患, 哮喘气道炎症的特征性改变为嗜酸粒细胞（EOS）的浸润和活化。气道黏膜下的 EOS主要来源于骨髓CD34+干细胞在某些细胞因子(如eotaxin, IL5)的诱导下分化成熟为EOS, 释放入外周血, 在多种趋化信号的引导下向肺内定向募集。这一现象意味着从骨髓循环气道, 存在着调控EOS及其祖细胞定向迁移的信号通路。趋化因子eotaxin对EOS有高度的特异性, 其受

4、体3(CCR3)在EOS膜上大量存在, 且与eotaxin 有高度亲和性, eotaxin是强有力的EOS趋化剂, eotaxin和CCR3 在哮喘发病机制中起重要作用。本实验我们探讨哮喘发作时骨髓和气道之间的调控EOS定向迁移信号通路; 通过研究CCR3及CD34的表达, 分析CCR3及CD34的改变对EOS在骨髓增殖分化及其在肺组织趋化和浸润的调节作用, 为临床开发治疗哮喘新方法提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 雄性豚鼠48只, 体质量(250±50)g, 由徐州医学院动物中心提供。随机分为对照组（N）、 哮喘组(根据处死时间分为A、 B、 C、 D、 E组), 每组

5、8只。鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA, 美国Sigma公司)、 CCR3、 CD34多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒(武汉Boster公司)、 奥林巴斯图像采集系统、 德国百瑞雾化器和自制雾化箱。 1.2 方法 1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘组于第1天腹腔注射抗原混悬液1 mL (OVA 100 mg、 氢氧化铝200 mg), 2周后将豚鼠放于自制雾化吸入箱内, 喷射雾化吸入10 g/L OVA 20 min, 连续5 d1。对照组于第1天腹腔注射1 mL生理盐水, 2周后喷射雾化吸入生理盐水20 min, 连续5 d。最后1次雾化吸入后, 哮喘组A、 B、 C、 D、 E分别

6、于30 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h处死动物, 对照组12 h处死, 取材并作相应测定。 1.2.2 骨髓和外周血EOS计数 于末次激发后, 断颈处死豚鼠, 取颈动脉血制作血涂片。取两侧股骨, 去掉两端骨骺, 剖开骨干髓腔, 以含肝素1667 kat/L的生理盐水溶液将骨髓细胞冲洗出, 4, 1 000 r/min离心5 min后沉渣, 涂于多聚赖氨酸处理的玻片上, 干燥后以40 g/L多聚甲醛固定30 min, -20保存备用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色, 随机计数200个白细胞, 并计算其中EOS百分比。 1.2.3 骨髓细胞CCR3、 CD34表达的检测 采用SA

7、BC免疫组织化学法检测骨髓中CCR3、 CD34的表达。以兔抗大鼠CCR3 IgG为一抗, 以生物素化的羊抗兔IgG为二抗。取骨髓沉渣涂片, 按SABC免疫组化试剂盒说明书处理。在光镜下观察结果, 胞膜为棕黄色者为阳性细胞, 在光镜(×400)下随机选取5个视野, 计数阳性细胞数占白细胞总数的比例。 1.2.4 肺组织EOS计数及CCR3、 CD34表达的检测 无菌操作下切取部分肺组织, 40 g/L多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋、 切片, 分别进行HE染色、 CCR3、 CD34免疫组化染色(严格按武汉Boster公司SABC试剂盒说明书操作) 。肺组织切片HE染色后, 每张切片计数

8、200个细胞, 计算其中EOS百分比。免疫组化计数方法: 光镜下观察胞膜着棕黄色为阳性细胞。每例选择1张染色较好的切片, 显微镜下随机选取5个高倍视野(×400), 计数, 取每视野的均数。 1.2.5 统计学分析 计量数据均采用x±s表示, 用 Stata7.0软件对数据进行t检验和相关分析, P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 哮喘豚鼠气道病理学改变 肺组织HE染色光镜下可见: 与对照组相比哮喘组大、 中、 小支气管收缩, 黏膜水肿, 平滑肌增厚, 上皮细胞肿胀, 部分上皮细胞变性、 坏死脱落, 杯状细胞增生, 支气管管腔狭窄甚至闭塞, 黏

9、液栓形成; 支气管周围血管扩张、 充血, 黏膜、 黏膜下层及肺泡区有大量的炎症细胞浸润, 主要为EOS、 淋巴细胞、 单核细胞; 肺泡间隔增厚。激发后30 min上述改变不明显, 6 h, 12 h肺组织病变最明显, 24 h, 48 h逐渐恢复到正常肺组织表现(图1)。 2.2 外周血涂片、 骨髓细胞涂片及肺组织EOS计数 哮喘（豚鼠）激发后30 min, 与对照组相比变化不大, 且外周血EOS百分比稍有下降, 但无统计学意义; 6、 12 h升高明显(P<0.01); 24 h开始下降(P<0.05); 48 h基本恢复到正常水平。哮喘组不同时间点之间EOS也存

10、在着变化: 6 h较30 min, EOS升高明显(P<0.01); 12 h较6 h, 肺组织EOS变化不大(P>0.05), 骨髓和外周血升高(P<0.05); 24 h较12 h, 48 h较24 h, EOS呈下降趋势(P<0.01); 6、 12 h时EOS增多最明显, 与气道病理学改变相一致, 24 h开始下降, 48 h回到正常水平。 骨髓变化先于肺和外周血, 且持续时间短(图2)。 2.3 肺组织和骨髓中CCR3和CD34蛋白的表达 哮喘组肺组织和骨髓中CCR3和CD34蛋白阳性细胞呈棕黄色, 主要定位于细胞膜。肺组织中,

11、 气道黏膜、 黏膜下层及血管周围、 肺泡区有大量呈棕黄色的阳性细胞, 气道黏膜上皮细胞、 血管内皮细胞及平滑肌细胞也有CCR3及CD34蛋白表达, 对照组在上述部位仅少量表达。骨髓细胞中, 呈棕黄色CCR3 蛋白阳性细胞大量表达于各阶段Eos细胞表面; 而CD34大量表达于未成熟的EOS祖细胞表面.不同时间点CD34的表达趋势和EOS的变化一致: 与正常组相比, 激发后30 min, 肺组织内表达升高（P<0.05）, 骨髓内略有下降, 不明显（P>0.05）; 6 h时, 肺内表达下降, 骨髓内开始升高（P<0.01）; 12 h时, 肺组织和骨髓内

12、CD34表达达到高峰（P<0.01）; 24、 48 h逐渐下降, 恢复到正常水平。但是CCR3的表达则稍有不同: 与对照组相比骨髓及肺组织中CCR3 30min时开始升高（P<0.05）; 6、 12 h达到高峰（P<0.01）; 24 h开始下降（P<0.05）; 48 h基本恢复到正常水平; 骨髓先升高, 肺组织随着变化, 但持续时间长于骨髓。表1 肺组织和骨髓中CCR3/CD34蛋白的表达 2.4 肺组织和骨髓EOS表达与CCR3蛋白表达的关系 EOS表达与CCR3蛋白的表达存在着线性关系: 肺组织, r=0.93, P&

13、lt;0.01; 骨髓, r=0.95, P<0.01; 总, r=0.94, P<0.01。EOS表达与CD34蛋白的表达存在着线性关系: 肺组织, r=0.27, P>0.05; 骨髓, r=0.71, P<0.01; 总, r=0.38, P<0.01。CCR3蛋白表达与CD34蛋白的表达存在着线性关系: 肺组织, r=0.28, P>0.05; 骨髓, r=0.6291, P<0.01; 总, r=0.37, P<0.01。 3 讨论 CCR3主要由单一肽链组成的7 个螺旋跨

14、膜结构, 属于G 蛋白藕联受体家族。CCR3 主要表达于EOS上, 介导其迁移及脱颗粒反应, , 在嗜碱性粒细胞、 CD4+T细胞和树突细胞表面仅少量表达。Lamkhioued等2研究报道, CCR3固有表达于骨髓CD34+造血细胞表面。另有文献3报道, 支气管上皮细胞也表达CCR3, 而且与支气管上皮细胞表达的表皮生长因子受体存在交叉干扰。Shannon 等4研究发现eotaxin及eotaxin2通过与CCR3的结合可以诱导部分CCR3内陷和EOS的变形, 有助于EOS的活化和迁移。Joubert等5发现eotaxin 作用于气道平滑肌细胞CCR3可诱导平滑肌细胞迁移和增殖, 使细胞内Ca

15、2+增高。Adachi 等6发现支气管上皮细胞表达CCR3可激活和诱导有丝分裂原激活蛋白（MAP）活化和细胞因子的产生。可见CCR3无论在气道炎症还是重塑方面都起到了重要作用。本实验发现哮喘时不但肺组织EOS浸润明显, CCR3表达增加, 而且黏膜上皮细胞, 平滑肌细胞上CCR3也有明显表达, 平滑肌增厚, 和既往研究一致。 以往研究表明, 在过敏性哮喘患者的骨髓中, 成熟和非成熟的EOS CCR3表达水平显著升高7。Lamkhioued等2研究证实, CCR3可表达于骨髓CD34+造血细胞表面, 在体内外eotaxin与CCR3结合后均表现出明显的趋化活性, 促使骨髓中CD34+细胞产生增多

16、, 只有CCR3-骨髓干细胞转化为CCR3的细胞后, 才可以募集到肺。并且单独或与IL5协同作用可以使骨髓CD34+祖细胞定向分化为EOS, 并向外释放、 募集8, 分化过程中CD34转为CD34-成熟EOS。本实验发现: 一方面, 哮喘组骨髓CCR3及CD34表达明显高于对照组, 与EOS之间互呈线性相关（肺内除外）, 并且CCR3的表达高峰在6 h, 早于CD34+阳性细胞和EOS增加、 释放的高峰时间12 h, 说明在某些因子的作用下, 骨髓祖细胞表达CCR3, 进一步使CD34祖细胞、 EOS分化、 释放增多, 利于炎症的发展。另一方面, 哮喘激发后速发相炎症反应, 肺内CD34阳性细

17、胞, EOS增加, 而骨髓内CD34阳性细胞减少, 血液内EOS减少, 随着时间发展, 迟发相炎症反应出现, 两者逐渐增加。考虑与早期炎症细胞的快速募集大于骨髓产生的速度有关。但是肺内CD34阳性细胞升高后有一下降过程, 后又升高, 考虑为快速募集后的原位造血, 使之消耗, 后来自骨髓的补给使其升高, 同时造成了肺内CCR3及CD34表达与EOS无明显的线性关系。证明在骨髓到外周血再到肺组织存在着密切的细胞信号环路联系。 近年研究的重点倾向于骨髓、 肺组织、 循环之间的细胞信号通路关系, 以便更好地为治疗哮喘开阔思路。如果能切断这方面的环路, 如通过抑制CCR3的表达, 或者给于其拮抗剂抑制C

18、D34表面抗原的表达, 不但切断EOS迁移, 而且切断了CD34造血干细胞的分化、 迁移, 将对哮喘的治疗有很重要的意义。【参考文献】 1 Daudurand RJ, Wang CG, Laberge S, et al. In vitro allergic bronchoconstriction in the brown norway ratJ. Am J Respir Crit Care Med, 1994, 149(6): 1499-1505.2 Lamkhioued B, Abdelilah SG, Hamid Q, et al. The CCR3 receptor is involve

19、d ineosinophil differentiation and is upregulated by Th2 cytokines in CD34+progenitor cellsJ. J Immunol, 2003, 170(1): 537-547.3 Tesuya AD, Chang2Hao C, Akira KA, et al. Activation of epidermal growth factor receptor via CCR3 in bronchial epithelial cellsJ. Biochem Biophs Res Commu, 2004, 320: 292-296.4 Bryan SA, Jose PJ, Topping JR, et al. Responses of leukocytes to chemokines inwhole blood and their antagonism by novel CCchemokine receptor 3 antagonistsJ. Am J Respir Crit Care Med, 2002, 165(12): 1602-1609.5 Joubert P, LajoieKadoch S, Labonte I, et al. CCR3 expression and function inasth