黄芪对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤p38MAPK表达的影响

1、黄芪对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤p38 MAPK表达的影响【摘要】 目的 探讨脂多糖（LPS）诱导急性肺损伤（ALI）大鼠肺组织磷酸化p38 MAPK表达的变化以及黄芪对其之影响。 方法 静脉注射LPS复制大鼠ALI模型。随机分成3组：正常对照组、ALI组和黄芪组。采用蛋白质印迹检测肺组织磷酸化p38 MAPK的表达，并观察大鼠动脉血氧分压（PaO2）、肺湿/干重比（W/D）、支气管肺泡灌洗液（BALF）白蛋白、血清TNF的变化以及肺组织病理学改变。结果 LPS诱导大鼠ALI时肺组织磷酸化p38 MAPK的表达较正常对照组显著增加（P<0.01）。黄芪注射液可显著抑制大鼠肺组织磷酸

2、化p38 MAPK表达，降低W/D、BALF白蛋白以及血清TNF含量，使下降的PaO2回升，减轻肺组织病理学损伤。 结论 ALI时肺组织p38 MAPK磷酸化表达增加；黄芪注射液对内毒素性肺损伤有保护作用，其机制可能与抑制磷酸化p38 MAPK的表达有关。 【关键词】 急性肺损伤；脂多糖；p38蛋白激酶；黄芪Effect of Astragalus on the Expression of p38 Protein Kinase in Rats with Lipopolysaccharideinduced Acute Lung Injury1 / 15 HUANG Cuiping,YANG He

3、ping (Department of Respiratory Diseases, the First Affiliated Hospital of Xianning University, Xianning Hubei 437100,China ) ABSTRACT:Objective To study the expression of p38 protein kinase in LPSinduecd acute lung injury (ALI) and the intervention effect of astragalus.Methods LPS was injected intr

4、avenously to prepare ALI model. The rats were divided into three groups randomly : control group, LPS group and astragalus group. The expression of phosphop38 protein kinase was analyzed by western blot. Changes of PaO2, wet/dried lung weight(W/D), albumin in BALF,TNF in serum and histopathology wer

5、e observed.Results Resting rat lung expressed a little phosphop38; the expression of phosphop38 was upregulated significantly in the lung after rats were injected with LPS (P<0.01). Compared with LPS group, astragalus significantly inhibited the expression of phosphop38, decreased PaO2, W/D,

6、albumin in BALF and TNF in serum (P<0.01), and alleviated histropathologic damage alleviated.Conclusion The expression of phosphop38 is upregulated in rat lung with LPSinduecd ALI. Astragalus injection has a protective effect on ALI and its therapeutic mechanism may be related to inhibition o

7、f the phosphorylation of p38 MAPK. KEY WORDS: Acute lung injury; Lipopolysaccharide; p38 protein kinase; Astragalus p38蛋白激酶通路是新近克隆和鉴定的一条丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号转导通路1，这条通路与炎症、应激反应的调控密切相关2。本研究采用静脉注射脂多糖（LPS）复制大鼠急性肺损伤（ALI）模型，通过检测动脉血氧分压（PaO2）、肺湿/干重比（W/D）、支气管肺泡灌洗液（BALF）白蛋白以及血清TNF含

8、量的变化，以评价p38 MAPK在LPS诱导肺损伤发病过程中的作用，并观察黄芪对肺组织p38 MAPK活化的影响，探讨黄芪防治肺损伤的机制。 1 材料和方法 1.1 ALI模型的复制 健康Wistar大鼠30只，雌雄不拘，体质量240280g（华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）。称重后，用20%乌拉坦5ml/kg体质量腹腔注射麻醉，随机分成3组：正常对照组，经颈外静脉注入生理盐水；ALI组，经颈外静脉注射大肠杆菌内毒素（LPS，O26：B6，美国Sigma公司）5mg/kg复制ALI模型；黄芪组，注射LPS后立即注入黄芪注射液1ml（批号0506075，含生药2g，上海福达制药有限公司）

9、。 1.2 标本处理 注射LPS 2h后，采取静脉血1ml，分离血清，-20保存待测TNF。采取动脉血1ml置于肝素化抗凝空针中，保持气密，检测PaO2。腹主动脉放血处死动物，分离气管，结扎右侧主支气管。以4ml磷酸盐缓冲液（PBS）进行肺灌洗，保留30s，回收灌洗液3ml，200×g离心10min，取上清-20保存待测白蛋白。取右肺下叶，放入液氮中速冻，-80保存，以提取组织总蛋白。其余右肺部分称湿重后置于烤箱中，90，20h完全脱水，称干重，计算湿/干重比值（W/D）。部分作石蜡切片、HE染色，观察病理学改变。 1.3 血清TNF和BALF白蛋白检测 分别采用放射免疫法（北京解放

10、军总医院试剂盒）和溴甲酚绿法（南京建成生物工程研究所）检测TNF和白蛋白浓度。 1.4 肺组织磷酸化p38 MAPK检测 速取冻存的肺组织约100mg，放入匀浆器中，加入5倍体积的Buffer（0.1M NaCl，0.01M Tris.Cl，pH7.6，0.001M EDTA，pH8.0，1g/ml抑肽酶，100g/ml PMSF），冰上匀浆10min。加入等体积的Buffer （0.1M Tris.Cl，pH6.8，0.2M DTT，4% SDS，20%甘油），沸水浴中加热10min。4，10000×g离心10min，取上清-70保存备用。Bradford法测其蛋白浓度。各组取总蛋

11、白50g加上样缓冲液（50mM Tris.Cl,pH6.8, 2% w/v SDS, 10% v/v glycerol, 1%巯基乙醇，0.01%溴芬蓝）进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白质，经电转印将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上（NC膜，Amersham公司）。NC膜经漂洗、封闭后加入稀释度为1400的兔抗磷酸化p38多克隆抗体（美国 Santa Cruz公司），4，孵育20h。然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，稀释度为1200，室温孵育1h。经TBS洗涤，DAB显色。用图象分析仪测定各条带的光密度值（OD）作定量分析。 1.5 统计学处理 实验数据以&#

12、177;s表示，均数差异的显著性采用方差分析和q检验完成，两变量间的相关程度用直线相关分析法分析。以P<0.05作为差异有统计学意义的界限。 2 结 果 2.1 大鼠动脉血氧分压（PaO2）的变化 本实验测得正常大鼠PaO2为14.30±1.21kPa。LPS刺激2h，PaO2显著下降（8.80±0.73kPa）；黄芪注射液干预后PaO2显著回升（12.15±1.26kPa），与LPS刺激组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），见表1。 2.2 肺组织W/D、BALF白蛋白以及血清TNF含量的变化 LPS刺激组肺组织W/D、BALF

13、白蛋白和血清TNF含量均较正常对照组显著增高（P<0.01），黄芪治疗后肺组织W/D、BALF白蛋白和血清TNF含量均较LPS刺激组显著降低（P<0.05），表明黄芪能减轻LPS诱导的肺水肿和血管通透性的增加，见表1。 2.3 肺组织磷酸化p38 MAPK的变化 蛋白质印迹结果显示大约在38kD的分子量位置上出现阳性条带。经图象分析发现，LPS刺激组肺组织磷酸化p38 MAPK的表达较正常对照组显著增加（P<0.01）。黄芪注射后肺组织磷酸化p38 MAPK的表达明显下降，与LPS刺激组相比，差异具有非常显著性差异（P<0.01）。提示黄

14、芪抑制p38 MAPK的活化（表1）。 2.4 肺组织磷酸化p38 MAPK与PaO2、W/D、BALF白蛋白以及血清TNF之间的相关分析 通过直线相关分析发现，肺组织磷酸化p38 MAPK与PaO2呈显著负相关（r=- 0.687，P<0.01），与W/D、BALF白蛋白呈显著正相关（r=0.780，0.824，P<0.01），与血清TNF无明显相关性（r=0.435，P>0.05）。 2.5 肺组织病理学观察 肉眼观察：正常对照组肺组织呈粉红色，未见明显充血、水肿、出血及梗死灶。LPS刺激组肺组织呈暗红色，肺体积增大，充血明显，可见广泛的点状或灶壮

15、出血。黄芪组肺表面充血、水肿较LPS刺激组减轻。 光镜检查：LPS刺激组可见肺间质弥漫性出血，肺泡腔内大量红细胞渗出和炎症细胞浸润。部分切片可见灶状肺不张、肺气肿。黄芪组仅见散在的肺泡膨胀，少量炎性细胞聚集。 表1 大鼠PaO2、肺W/D、BALF白蛋白、血清TNF、肺组织磷酸化p38表达的比较 与正常对照组比较，* P<0.01；与LPS刺激组比较， P<0.05，P<0.01 3 讨 论 革兰氏阴性菌细胞壁的LPS是引起SIRS、ALI和ARDS的重要原因。肺脏是内毒素最常累及和最先攻击的靶器官，由此引发的呼吸功能衰竭是导致患者死亡的直接原因。LP

16、S作为介导全身炎症反应的重要物质，不仅可通过刺激炎症效应细胞产生炎性介质和细胞因子，而且在启动体内免疫系统反应，导致中毒性休克中有重要作用。本研究证实静脉注射LPS能显著降低大鼠PaO2，增加肺组织W/D和BALF白蛋白含量，显微镜观察肺间质弥漫性出血，肺泡腔内炎症细胞浸润、红细胞渗出，表明ALI模型是成功的。 腹腔注射LPS复制小鼠ALI模型，应用递增浓度的特异性p38 MAPK抑制剂SB203580能呈剂量依赖性地抑制血清TNF水平，其50%抑制浓度为15mg/kg。Nick等亦证实新型p38 MAPK抑制剂M39能显著降低LPS诱导的小鼠BALF中性粒细胞聚集3。本实验亦证实静脉注射LP

17、S 能显著刺激肺组织p38 MAPK的磷酸化表达，磷酸化p38 MAPK即可作用于下游多个转录因子，如ATF24、Chopl105、MEF2C6等而调节炎症介质的释放，提示p38 MAPK可能在LPS诱导肺损伤的发病机制中发挥重要作用。 黄芪作为益气养血的扶正药物，具有补气固表、利尿托毒、敛疮生肌的功能。黄芪注射液含有活性较强的三萜皂甙、黄酮类、多糖类、氨基酸和微量元素，能抗菌、抗病毒、提高机体免疫功能7,8。我们在以往的实验中亦证明黄芪注射液能改善油酸所致的肺损伤9。本实验应用黄芪注射液对LPS诱导的ALI进行了干预治疗，结果显示黄芪注射液能显著降低肺组织W/D以及BALF中白蛋白和血清TN

18、F含量，提高PaO2，改善缺氧，并且显著抑制LPS诱导的肺组织p38 MAPK磷酸化。分析p38 MAPK磷酸化程度与PaO2、W/D、BALF白蛋白以及血清TNF之间的相关性，结果发现虽然p38与血清TNF无明显相关性，但与PaO2呈显著负相关，与W/D、BALF白蛋白呈显著正相关，提示黄芪注射液治疗ALI的机制可能与抑制p38 MAPK的磷酸化活化有关。这种抑制是直接作用还是间接作用，尚需进一步通过分子生物学研究加以证实。【参考文献】 1Cuenda A Rousseau S. p38 MAPkinases pathway regulation, function and role in

19、human diseasesJ. Biochim Biophys Acta，2007，1773(8):13582Herlaar E，Brown Z.p38 MAPK signaling cascades in informatory diseaseJ.Mol Med Today,1999,5（10）:4393Nick JA,Young SK,Brown KK,et al.Role of p38 mitogenactivated protein kinase in a murine model of pulmonary inflammationJ.J Immunol,2000,164(4):21514Jiang Y,Chen C,Li Z