微生物检验实验室菌种保存程序

1、微生物检验实验室菌种保存程序1.目的规范菌种保存程序。2.范微生物实验室保存的标准菌种和来自临床的标本菌株。3.职责微生物实验室检验人员正确执行本程序O4.程序4.1 需氧菌保存法4.1.1 一般保存法见表6-1表6；常见菌种培养基保存期限菌种培养时间培养基保存温保存时间流感嗜血杆菌 18-24脱纤维羊血或脱脂牛奶-20 6个月葡萄球菌、链球菌18-24血琼脂斜面（高层加液体石蜡）肠杆菌科4818-2413年Soxbean酪蛋白琼脂（高层加液48体石蜡）肠杆菌科、非发酵菌、葡萄球菌等18-24牛肉汤（6 1苛养菌18-245%小牛血清肉汤-206个月分枝杆菌幽门螺杆菌18-24罗氏培养基（加液

2、体石蜡）48 3个月18-24心脑浸液或布氏肉汤加入甘油-70 6年注：保存郡主均需培养1824h。4.1.2 冷冻干燥法将待保存菌培养1824小时后，挑取 菌落加入一定量的牛肉汤或心脑浸出液加入20%的蔗糖，混 匀，分装于安甑中，置70低温冰箱中迅速冻结，再放入冷 冻干燥机内，抽真空1624小时，然后将安甑封口，置低温 冰箱保存。大多数菌株可保存10年以上，甚至更长。4.1.3 超冰冻法保存菌株初代培养1824小时的菌落、 菌苔，加入0.5l.0ml无菌脱纤维羊血安甑中，封口，置液 氮或.40冰箱中保存。4.2 厌氧菌保存法4.2.1 短期保存方法4.2.1.1 疱肉培养基保存法用牛肉渣和牛

3、肉浸出液制成 疱肉培养管，接种待保存菌株，然后覆盖厂2cm的石蜡，再 将培养管垂直放置片刻，待石蜡凝固置35培养（无芽胞厌 氧菌培养72小时，普通梭菌培养24小时，产气荚膜梭菌和 多枝梭菌培养2周左右），最后置室温或20保存。发酵糖 类的厌氧菌每个月转钟1次，不发酵糖类的厌氧菌36个月 转钟1次。4.2.1.2 半固体培养基保存法在上述液体培养基中加入。2%0.5%琼脂，制成半固体培养基，接种时用毛细管将 待保存的厌氧菌的菌液加入半固体培养管底，表面加入2cm厚度的液体石蜡，密封管口，培养48小时，置室温4.2.1.3 甘油乳剂培养基保存法在厌氧液体培养基（含胰蛋白陈、牛肉膏、酵母浸液、L半胱

4、氨酸和维生素K等） 中加入少量牛肉渣分装于长试管中，接种待保存菌株,35c培养4872小时，取出后加入无菌甘油（按1:1比例）, 盖紧盖子后用石蜡封口，置4或-20保存。此法适用于保 存脆弱拟杆菌、产黑色素普雷沃菌和具核梭杆菌。4.2.2 长期保存法4.2.2.1 低温冷冻保存法（厌氧菌在低温条件下新陈代 谢处于抑制状态，不繁殖也不死亡）培养基包括脱纤维羊血、 兔血或马血，20%脱脂牛乳，7.5%葡萄糖的马血清。将待保 存菌株（培养2448小时）加入上述培养基中，封好瓶口， 置70液氮或-70C低温冰箱中保存。菌种不同造成保存时 间差异，最长可保存10年，最短可保存2年以上。4.2.2.2 冷

5、冻真空干燥法冷冻真空干燥法的培养基（保 存剂）有两种，一种是用10%20%脱脂牛奶加入0.1%的谷氨 酸钠和0.03%的L.半胱氨酸，煮沸15分钟消毒，冷却备用。 另一种是用10%蔗糖与马血清的混合液，过滤灭菌，并置厌 养，酵母菌24日，产抱子的丝状真菌需形成成熟的抱子， 不产抱子的真菌生长成健壮的菌丝为止。覆盖2cm的无菌石 蜡（矿物）油（石蜡油的灭菌一般在1小时以上，然后将自 然冷却的石蜡油加入含真菌的试管中，使液面高于斜面顶部 1cm左右）。使用此方法，许多真菌可在室温下存活数年。在恢复培养时，先从石蜡油下面挑取一小块（2-3mm3） 菌落，沿试管壁边挑取边挤压过多的石蜡油（因石蜡油过多 会抑制真菌生长），然后接种于沙氏琼脂斜面上，培养数日 并观察生长情况。4.4.3水保存法将真菌接种于培养基的斜面上，待培养 成熟后，将无菌蒸