实验一兔血清 免疫球蛋白分离与纯化PPT课件

1、实验课要求实验课要求 预习预习 不迟到、早退、不旷课、有事请假不迟到、早退、不旷课、有事请假 穿白大褂、注意自我防护穿白大褂、注意自我防护 不能喧哗，不做与实验无关的事不能喧哗，不做与实验无关的事 认真完成实验报告认真完成实验报告 值日要求：擦桌子、拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗值日要求：擦桌子、拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗第1页/共17页一、实验目的二、实验原理三、实验仪器及试剂四、实验步骤五、注意事项六、数据处理及计算 实验一实验一 兔血清免疫球蛋白分离兔血清免疫球蛋白分离第2页/共17页一一 、实验目的、实验目的 学习并掌握盐析法的原理及用盐析法进行免疫球蛋白分离与纯化的技术。（I

2、gG ）第3页/共17页 抗体结构抗体结构第4页/共17页二、实验原理一二、实验原理一 盐析盐析 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减弱甚至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由弱甚至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，这个过程叫做盐析。集而沉淀，这个过程叫做盐析。第

3、5页/共17页实验原理实验原理- -盐析盐析 不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，加入不同浓度的中性盐可分阶段从溶液中沉淀出来。不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，加入不同浓度的中性盐可分阶段从溶液中沉淀出来。 蛋白质盐析中最常用的盐是硫酸铵蛋白质盐析中最常用的盐是硫酸铵 硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀第6页/共17页三、 实验仪器及试剂1. 实验材料：血清（兔免疫血清）。2. 试剂：0.01mol/LpH7.4 PBS、0.5 mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、饱和硫酸按（用前以5mol/ L NaOH调至pH7.4）、奈氏试剂。第7页/共17页三、三、 实验仪器

4、及试剂实验仪器及试剂3. 用具：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或双蒸水煮沸10min）、饭盒（装碎冰）等。4. 仪器：搅拌器、离心机等。5. 溶液配制第8页/共17页三、实验试剂 饱和硫酸铵溶液的配制： 称（NH4）2SO4400425克，以7080之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（28%氨溶液）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。 第9页/共17页磷酸盐缓冲液 0.2M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制。贮存液：A液： 0.2M NaH2PO4：Na

5、H2PO42H2O 31.2克，加蒸馏水至1000ml； B液： 0.2M Na2HPO4：Na2HPO412H2O 71.7克，加蒸馏水至1000ml； 应用液：取A液19ml加B液81ml混合，再以生理盐水作10倍稀释，加入NaCl至终浓度为0.85%，即为PBS。 第10页/共17页柰氏试剂 HgI 11.5g，KI 8.0g，加双蒸水至50ml；搅拌溶解后过滤，滤液中再加入浓度为20%的溶液NaOH 50ml。第11页/共17页四、实验步骤四、实验步骤1 兔免疫血清的制备兔免疫血清的制备第12页/共17页2 硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀（1）取制备好的血清20ml，逐滴加入（NH4）2

6、SO4饱和溶液20ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置10min。（2）3000r/min离心10min，弃去上清。（3）用6ml磷酸盐缓冲液溶解沉淀，再加（NH4）2SO4饱和溶液3ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置10min。（4）3000r/min离心10min，弃上清。（5）为进一步纯化，可重复步骤3 23次。第13页/共17页3 3 透析去盐透析去盐（6）用5mlPBS溶解沉淀，装入透析袋。（7）透析除盐，中间换液数次，至奈氏试剂测透析外液无黄色。第14页/共17页五、数据处理及计算蛋白含量（mg /mL）（1. 45OD 280nm 0. 74 OD 260nm） 样品稀释度 注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。蛋白质及其定量鉴定：取样品少许作适量稀释，以紫外分光光度计测量蛋白含量 260、280nm处读数第15页/共17页实验报告的要求 题目、原理