基因工程的基本操作程序PPT课件

1、 目的基因第1页/共46页C下列不是基因载体必须具备的条件的是下列不是基因载体必须具备的条件的是 ( )( ) A A、能自我复制、能自我复制 B B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C C、具有标记基因、具有标记基因 D D、它是环状、它是环状DNADNAD第2页/共46页第3页/共46页真核生物的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点前体信使RNA成熟的信使RNA第4页/共46页第二节基因工程的基本操作程序第5页/共46页（一）获得目的基因（二）构建基因表达载体形成重组DNA分子（三）将目的基因导入受体细胞（四）目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序第6页/共46页用

2、用DNADNA合成仪人工合成合成仪人工合成利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增已知序列：已知序列：从基因文库获得从基因文库获得未知序列：未知序列：（一）目的基因的获取：目的基因即我们所需要的 基因。基因组文库：含某种生基因组文库：含某种生物的全部基因物的全部基因部分基因文库：含某种部分基因文库：含某种生物的部分基因生物的部分基因（如（如cDNAcDNA文库）文库）第7页/共46页cDNA文库基因组文库从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因第8页/共46页鸟枪法：散弹射击法供体细胞DNA限限制制酶酶许多DNA片段载入载体导入受体细菌扩增产生特定性状分离目的基因构建基因组文库并获得目的基

3、因：第9页/共46页 基因组DNADNA文库的构建 将总DNADNA经过酶解，分离不同长短的DNADNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。第10页/共46页目的基因的mRNA逆转录单链DNA合成双链DNA（目的基因）逆转录法构建cDNA文库并获得目的基因载入载体导入受体细菌扩增产生特定性状分离目的基因第11页/共46页第12页/共46页第13页/共46页蛋白质氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测结构基因的核苷酸序列（单链）根据已知氨基酸序列直接合成DNA化学合成人工合成核苷酸序列已知，把将要合成的DNA序列输入到D

4、NA合成仪，用化学方法直接人工合成第14页/共46页聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR是由美国科学家是由美国科学家第15页/共46页 PCR的反应体系的反应体系 模板：模板：DNA 原料：原料：四种四种 脱氧核苷酸；脱氧核苷酸； 酶：酶：Taq酶（酶（ TaqDNA聚合酶）聚合酶）嗜热细菌中分离得到嗜热细菌中分离得到 引物：引物：DNA片段片段 MgMg2+2+（维持酶活性所必需）（维持酶活性所必需） PCRPCR缓冲液：缓冲液：维持PH恒定，保护Taq酶 第16页/共46页1变性 双链模板DNA解离为单链结构。（9095）DNA双链DNA单链变性第17页/共46页2退火 引物与模板互补

5、成双链。 （5560） (由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。)引物第18页/共46页3延伸 在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。7075延伸第19页/共46页变性变性第二次循环第20页/共46页退火退火第二次循环第21页/共46页延伸延伸第二次循环第22页/共46页 PCRPCR反应曲线反应曲线 理论上，理论上，PCRPCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增25-3025-30个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。产物量不再随循环次数的增加而

6、呈指数增长。第23页/共46页PCR仪程序设定第24页/共46页PCR的应用 PCRPCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCRPCR技术在技术在分子生物学、医分子生物学、医学和案件侦破学和案件侦破等领域得到广泛应用。等领域得到广泛应用。第25页/共46页实例 1： 1、下列获取目的基因的方法中需要模板链是（ ） A.从基因文库中获取目的基因 B.利用PCR技术扩增目的基因 C.反转录法 D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成第26页/共46页（二）基因表达载体的构建形成重组DNA分子切割目的

7、基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？同一种第27页/共46页目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用。第28页/共46页目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为定和表达的过程，称为转化转化。常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、 土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等 将目的基因导入受体细胞第29页/共46页主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。导入方式：导入方式：（三）将重组DNA分子导入受体细

8、胞第30页/共46页导入微生物细胞将目的基因克隆到大肠将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：杆菌细胞中的操作步骤：1)1)获得目的基因和质粒载体；获得目的基因和质粒载体；2)2)形成重组质粒；形成重组质粒；3)3)制备制备感受态细胞感受态细胞，用重组质，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；粒转化大肠杆菌细胞；4)4)培养大肠杆菌，让重组质粒培养大肠杆菌，让重组质粒形成大量拷贝；形成大量拷贝；5)5)筛选含重组质粒的大肠杆菌筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞。细胞。第31页/共46页导入植物细胞：导入植物细胞：土壤农杆菌转化法土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物和裸子植物土壤农杆菌：具有趋化性（酚

9、），感染双子叶植物和裸子植物第32页/共46页基 因 枪 法：单子叶植物常用的一种基因转化方法，但成本较高。花粉管通道法：十分简便经济的方法。我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。第33页/共46页 将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序： 重组DNA提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵发育 新性状动物第34页/共46页转基因动物第35页/共46页1.1.筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。（1）抗药性筛选法：菌株为某种

10、抗生素缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如抗氨苄青霉素，抗卡拉霉素等）。如何筛选出含有目的基因的受体细胞？（这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。）（四）目的基因的检测与鉴定（四）目的基因的检测与鉴定第36页/共46页pBR322质粒结构如果外源如果外源DNA插入，插入，氨卞青霉素氨卞青霉素抗性基因失抗性基因失活活标记基因标记基因进行筛选进行筛选限制性内切酶限制性内切酶识别序列识别序列外源基因连接外源基因连接PStPSt自主复制自主复制第37页/共46页（2 2） DNA分子杂交检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因首先取出转基因生物的基因组DNA用含目的基因的DNA片

11、段（单链）用放射性同位素等作标记,以此做探针使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中过程:第38页/共46页利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆检测方法：DNA分子杂交技术第39页/共46页DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的单链放在一起，如果这两个单链分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 第40页/共46页2.检测目的基因的表达检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质目的基因成功表达的标志体现特定性状检测性状第41页/共46页 （3 3）鉴定（个体生物学水平）：（1 1）检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA（2 2）检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法: :分 子 杂 交方法: :抗原抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA第42页/共46页第43页/共46页回答问题：1、基因工程的别名：2、操作环境：3、