单克隆抗体制备

1、编辑ppt实验研究的目的性实验研究的目的性 功能、形态、数量功能、形态、数量实验设计的科学性实验设计的科学性 全面、动态、鲜明、对应、对照全面、动态、鲜明、对应、对照实验方法的合理性实验方法的合理性 确切、先进确切、先进实验原理的内涵性实验原理的内涵性 意义、要点意义、要点实验操作的规范性实验操作的规范性 准备、严格、准确、重复准备、严格、准确、重复编辑ppt免疫血清和单克隆抗体的制备免疫血清和单克隆抗体的制备编辑ppt一、免疫血清的制备一、免疫血清的制备1. 原理：原理： 机体具有多种机体具有多种B细胞克隆，细胞克隆，将适当的抗原物质注入人将适当的抗原物质注入人或动物体内或动物体内后可被不同

2、的后可被不同的B细胞克隆同时识别，细胞克隆同时识别，经过一定经过一定时间，时间，受刺激的受刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆细胞克隆产生单克隆抗体，此获得的血清即为含多种单克隆抗体的产生单克隆抗体，此获得的血清即为含多种单克隆抗体的混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。 优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免

3、疫途原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。编辑ppt编辑ppt4. 抗原的处理抗原的处理1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数剂，直接免疫。菌体数11010个个/ml 为宜。为宜。2）可溶性蛋白质抗原（如人）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂 （1：1 V/V）混合、乳化。）混合、乳化。3）半抗原（多

4、糖、多肽、激素、化学药品）需与载）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载 体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥）、钥 孔嘁血蓝素孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联 剂。剂。编辑ppt编辑ppt3. 弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂 1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡）配方：羊毛脂：液体石

5、蜡 为为1：2，也可，也可1：1。 灭活卡介苗灭活卡介苗（2 2 20mg/ml20mg/ml）。）。4. 弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 剂。剂。5. 用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。编辑ppt编辑ppt编辑ppt2. 可溶性抗原免疫可溶性抗原免疫 1）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行 加强免疫，以后每隔加强免疫，以后每隔2周加强免疫一次。周加强免疫一次。 2）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静

6、脉、 小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验 测定血清效价测定血清效价1：32或或ELISA法测定抗体效价法测定抗体效价 1：10 000，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉 或心脏全部血液，分离血清。或心脏全部血液，分离血清。 4）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需45 次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免 疫。疫。 3. 颗粒性抗原免疫颗粒性抗原免疫 第一周注射第一周注射2次，随后每周加强免疫次，随后每周加强免疫1次，次，45天天

7、 试血。试血。编辑ppt3. 操作程序操作程序 1）健康雄性家兔体重）健康雄性家兔体重2.5 3 kg，背部皮下多点注射。，背部皮下多点注射。2）基础免疫：抗原完全佐剂）基础免疫：抗原完全佐剂 (抗原剂量抗原剂量4mg/只只) 2ml (1:1V/V) 吸入两支注射器内，三通连接，吸入两支注射器内，三通连接， 反复推拉混合至乳化悬液。反复推拉混合至乳化悬液。3）加强免疫：抗原不完全佐剂）加强免疫：抗原不完全佐剂 (抗原剂量抗原剂量2.5mg/只只)， 间隔间隔710天加强一次。约天加强一次。约23次。次。4）试）试 血：末次注射后第血：末次注射后第7天取少量静脉血，免疫双天取少量静脉血，免疫双

8、 扩试验血清检测，抗血清效价扩试验血清检测，抗血清效价 1：32（或（或 ELISA法检测抗体效价法检测抗体效价1：10，000）时颈）时颈 动脉放血，分离血清，分装，保存。动脉放血，分离血清，分装，保存。编辑ppt二二 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 1975年年 Kohler和和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学单克隆抗体杂交瘤技术，这

9、项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。的研究进入了一个高度准确的新纪元。编辑ppt编辑ppt 2. 试剂与器材试剂与器材（1）细胞融合剂：聚乙二醇（）细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/L L-谷氨酰胺贮存液谷氨酰胺贮存液（3）200 双抗（青、链霉素）溶液双抗（青、链霉素）溶液（4）RPMI-1640培养液培养液（5）15%胎牛血清胎牛血清RPMI-1640培养液培养液（6）100 氨基蝶呤（氨基蝶呤（A）贮存液）贮存液（7）100 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（8）1 HAT培养液培养液（9）1 HT培养液培养液（10）100 8

10、-杂氮鸟嘌呤贮存液杂氮鸟嘌呤贮存液编辑ppt（11）细胞冻存液：）细胞冻存液：90ml含含30%FCS的的RPMI-1640培养培养 液液+10ml DMSO （12）0.2M pH 7.4 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（13）主要仪器设备：）主要仪器设备：CO2培养箱、超净工作台、倒置培养箱、超净工作台、倒置 显微镜、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、显微镜、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、 离心机、高压灭菌器、烤箱、水浴锅、除菌滤离心机、高压灭菌器、烤箱、水浴锅、除菌滤 器、酶联免疫测定仪等。器、酶联免疫测定仪等。（14）常规实验器材：血细胞记数板、各种吸管、离心）常规实验器材：血细胞记数板

11、、各种吸管、离心 管、细胞培养瓶、培养皿、管、细胞培养瓶、培养皿、24孔和孔和96孔培养板、孔培养板、 细胞冻存管、注射器、微量移液器等。细胞冻存管、注射器、微量移液器等。（15）抗体纯化器材与试剂。）抗体纯化器材与试剂。（16）小鼠实验器材：手术剪刀、镊子等解剖器材。）小鼠实验器材：手术剪刀、镊子等解剖器材。（17）骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞系）骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0或或NS-1。编辑ppt3. 实验流程实验流程（1）实验动物免疫：）实验动物免疫：BALB/c小鼠，雌性，小鼠，雌性，68W。 常规免疫方案：常规免疫方案：0、15、30天，天，72 h后制备脾细后制备脾细 胞悬

12、液。胞悬液。基础免疫：基础免疫：10100 g抗原抗原 (可溶性抗原可溶性抗原)完全佐剂完全佐剂 0.2ml (1:1V/V) ，背部皮下多点注射。，背部皮下多点注射。加强免疫：同量抗原不完全佐剂，间隔加强免疫：同量抗原不完全佐剂，间隔710天一天一 次。约次。约23次，皮下或腹腔注射。次，皮下或腹腔注射。 试试 血：取静脉血，血：取静脉血，ELISA法检测血清中抗体滴度，法检测血清中抗体滴度， 当效价达到当效价达到 1：400以上时，进行加强免疫。以上时，进行加强免疫。 弱免疫原免疫方案：弱免疫原免疫方案：0天、天、30天、天、45天、天、60天、天、75天。天。编辑ppt（2）免疫动物脾细

13、胞悬液的制备）免疫动物脾细胞悬液的制备 ： 将末次免疫后将末次免疫后3天天BALB/c小鼠处死，消毒，无菌小鼠处死，消毒，无菌取出脾脏，置入无菌取出脾脏，置入无菌PBS或培养液中。在或培养液中。在100目的钢网目的钢网上研磨脾脏。收集细胞于上研磨脾脏。收集细胞于50ml离心管中，离心管中，1500rpm离心离心5分，去上清。加入分，去上清。加入10ml PBS用吸管轻微混匀，用吸管轻微混匀，1500rpm离心离心5分，去上清，用分，去上清，用10ml RPMI培养液悬浮。培养液悬浮。 细胞计数（细胞数细胞计数（细胞数/ml=N/4 104 稀释倍数）稀释倍数） 用用1640培养液调整细胞浓度至

14、培养液调整细胞浓度至1 108 /ml 编辑ppt（3 3）饲养细胞制备）饲养细胞制备 在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细所加入的细胞称饲养细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细胞胞。 将正常将正常BALB/cBALB/c小鼠腹部消毒后，注射预冷的无血小鼠腹部消毒后，注射预冷的无血清培养液清培养液5ml5ml，轻揉腹部数次，于腹部左下处剪开腹膜，轻揉腹部数次，于腹部左下处剪开腹膜，吸取细胞悬液，反复吸取细胞悬液，反

15、复2 23 3次，用培养液离心洗涤次，用培养液离心洗涤2 2次。次。用用15%FCS-RPMI-164015%FCS-RPMI-1640调细胞浓度为调细胞浓度为2 2 10105 5/ml/ml，将细胞，将细胞接种于接种于9696孔培养板，孔培养板，100100 l/l/孔。孔。 编辑ppt（4 4）骨髓瘤细胞的准备）骨髓瘤细胞的准备 复苏骨髓瘤细胞用复苏骨髓瘤细胞用1010FCS-RPMI-1640FCS-RPMI-1640培养液培培养液培养养1 1周，周，2 23 3天换液一次，依细胞生长情况天换液一次，依细胞生长情况3 34 4天传代天传代一次，适宜密度一次，适宜密度3 310105 5

16、/ml/ml。融合之前。融合之前3 3天，每天换一天，每天换一半培养液，使细胞保持在对数生长期。取对数生长骨半培养液，使细胞保持在对数生长期。取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2 2次，次，调细胞浓度调细胞浓度为为12 107 / ml备用。备用。 编辑ppt编辑ppt（6）融合细胞观察、换液及杂交瘤抗体检测）融合细胞观察、换液及杂交瘤抗体检测 细胞培养细胞培养3天后，使用天后，使用HAT培养液换液；培养液换液；3天后，再天后，再次使用次使用HAT培养液换液。培养液换液。 当细胞克隆集落大于当细胞克隆集落大于3mm时，利用间接时，利用间接ELISA法筛法筛

17、选分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。选分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。编辑ppt（7）杂交瘤细胞克隆化）杂交瘤细胞克隆化 将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀释法稀释细胞（用稀释法稀释细胞（用HAT培养液稀释细胞），于培养液稀释细胞），于96孔孔培养板中加入培养板中加入0.1ml/孔，培养孔，培养2周，利用间接周，利用间接ELISA法法挑选单个阳性杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，挑选单个阳性杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至亚克隆时全部克隆孔细胞培养上清中抗体检出阳直至亚克隆时全部克隆孔细胞培养上清中抗体检出阳性率为性率为100%为

18、止。为止。编辑ppt（8）杂交瘤细胞冻存与复苏）杂交瘤细胞冻存与复苏 将阳性细胞克隆在培养板或培养瓶中扩大培养，将阳性细胞克隆在培养板或培养瓶中扩大培养，收集细胞，离心收集细胞，离心1000转、转、5分，弃上清，加入细胞冻存分，弃上清，加入细胞冻存液，移至冻存管，液，移至冻存管，-70冰箱过夜，然后液氮长期保存。冰箱过夜，然后液氮长期保存。 将冻存管从液氮中取出，立即放入将冻存管从液氮中取出，立即放入37水浴中，水浴中，使之迅速融化。用培养液洗涤使之迅速融化。用培养液洗涤1次后，加入培养液继续次后，加入培养液继续培养。培养。编辑ppt（9）单克隆抗体的大量制备）单克隆抗体的大量制备 BALB/

19、c雌性小鼠接种杂交瘤细胞前雌性小鼠接种杂交瘤细胞前12周，腹腔注周，腹腔注射降植烷预处理。用无血清培养液洗涤杂交瘤细胞射降植烷预处理。用无血清培养液洗涤杂交瘤细胞23次，次，调细胞浓度调细胞浓度12 106/ml，每只小鼠腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.51ml细胞细胞悬液。待小鼠腹部明显膨大时，收集腹水，离心，收集上悬液。待小鼠腹部明显膨大时，收集腹水，离心，收集上清，分装，清，分装，-80保存。保存。编辑ppt（10）单克隆抗体纯化）单克隆抗体纯化盐析法盐析法 腹水腹水10ml等量生理盐水混匀，在电磁搅拌下逐等量生理盐水混匀，在电磁搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸胺滴缓慢加入饱和硫酸胺20ml，4

20、放置放置0.5h以上或过夜。以上或过夜。离心（离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加生理盐水，弃上清。沉淀加生理盐水20ml溶解后，再次加入饱和硫酸胺溶解后，再次加入饱和硫酸胺10 ml，4放置放置0.5h或过夜。离心（或过夜。离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加尽，弃上清。沉淀加尽量少生理盐水溶解，装入透析袋中，用流动自来水透量少生理盐水溶解，装入透析袋中，用流动自来水透析析40min，再用生理盐水透析，再用生理盐水透析24h，中间换液，中间换液34次，检次，检测无测无NH4离子存在即可。离子存在即可。-20备用。备用。编辑ppt凝胶柱层析凝胶柱层析 实验原理：实验原理

21、： 凝胶本身是多孔的分子筛，在交联剂作用下形成凝胶本身是多孔的分子筛，在交联剂作用下形成三维空间网状结构，蛋白质溶液流经凝胶柱时，根据三维空间网状结构，蛋白质溶液流经凝胶柱时，根据蛋白质分子量的大小不同，由大到小洗脱而进行分离。蛋白质分子量的大小不同，由大到小洗脱而进行分离。（大分子蛋白质不能进入凝胶粒内部，在胶粒间隙随（大分子蛋白质不能进入凝胶粒内部，在胶粒间隙随洗脱液最先流出。而小分子蛋白质进入胶粒内部洗脱洗脱液最先流出。而小分子蛋白质进入胶粒内部洗脱较慢。）较慢。） 关键点：关键点：1. 装柱切忌有气泡和断层，有断层要重装柱；装柱切忌有气泡和断层，有断层要重装柱；2. 加样时缓冲液面恰好在滤纸片上，及时加样避免柱加样时缓冲液面恰好在滤纸片上，及时加样避免柱 干涸，干涸凝胶不能继续使用；干涸，干涸凝胶不能继续使用；3. 因操作时间长，宜在因操作时间长，宜在4操作，防止影响免疫球蛋白操作，防止影响免疫球蛋白 活性。活性。编辑ppt（1111）单克隆抗体免疫学性质检定）单克隆抗体免疫学性质检定 1 1）单克隆抗体特异性测定；）单克隆抗体特异性测定； 2 2）单克隆抗体亚类测定；）单克隆抗体亚类测定； 3 3）单克隆抗