地中海贫血的产前诊断

1、地中海贫血的产前诊断 地中海贫血(地贫)是人类遗传性血红蛋白(Hb)病的一种类型,该病是由于人类珠蛋白基因的先天性缺陷而导致相应的珠蛋白链合成缺乏或完全缺如,形成Hb的链与非链比例失衡,从而使患者产生中度或严重的溶血性贫血表现。由于早期报道的病例几乎都是来自于地中海地区的移民,该病遂被命名为地中海贫血,后来发现地贫并非一种而是一组疾病,且在全球热带和亚热带广为流行的遗传性溶血性疾病。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型,地贫可以分为地贫、地贫、地贫、地贫、地贫和地贫等。和地贫是人群中最常见的地贫类型。目前,全世界至少有亿人携带地贫的致病基因,全球地贫基因携带者频率高达%,包括中国南方在内的东南亚地

2、区、印度次大陆、地中海地区、中东、北非和太平洋地区都是该病的高发地区。 20世纪70年代中期,分子遗传学的兴起使和地贫成为世界上最早被说明分子水平根底的人类单基因病之一;70年代末期,对和珠蛋白基因簇的结构鉴定和染色体定位的研究成果,奠定了开展地贫产前诊断的基石。在前人说明珠蛋白基因结构和基因缺失类型的根底上,1976年,美国华裔科学家简悦威(Kan Yuetwai)应用液相杂交技术,对珠蛋白基因cDNA进行定量检测,并检测其与胎儿DNA(培养的羊水细胞)的杂交率,实现了对珠蛋白基因缺失拷贝数的检测,结果显示,被测胎儿DNA的杂交率(65%)明显高于其双亲(携带者)的杂交率(57%)因此判定该

3、胎儿为健康胎儿。这一研究工作是世界上第一次采用分子诊断技术完成的人类单基因遗传病的临床实践,也是人类单基因病产前诊断的第一个成功案例,开创了人类遗传性疾病分子诊断的先河。 一、产前诊断地贫的历史回忆 由于地贫的治疗代价昂贵且难以治愈,通过产前诊断阻止重型地贫患儿出生是目前公认的首选预防措施。探索地贫产前诊断的研究工作最早始于20世纪60年代末,研究发现,地贫患儿脐带血中珠蛋白链的合成明显低于健康新生儿,随后的研究工作证实,从孕中期脐血中也可以检测出孕妇Hb的水平。这些研究促进了在20世纪70年代中、末期采用胎盘穿刺取样进行胎儿血的地贫产前诊断的临床实践。由于受分析技术的限制和相关根底研究的欠缺

4、,当时的地贫产前诊断只是一些零星的个案报道。 地贫产前诊断在临床上的广泛开展得益于相关分子遗传学根底的深入研究和DNA检测技术的开展。如前所述,1976年由简悦威(Kan YuctWai)博士首次报道的针对地贫的产前分子诊断的临床实践,对推动地贫乃至人类遗传病的产前诊断是一个划时代的事件。随后,于20世纪70年代末开始,以英国和美国为首的科学家对人类和地贫的分子机制进行了广泛的深入研究,详细说明了和珠蛋白基因的结构和功能,以及导致地贫的基因缺失类型及其与临床表型的关系;同时,地贫作为历史上最先被说明的人类单基因遗传病,又是最早采用PCR技术应用于临床产前诊断的遗传性疾病。概括起来讲,该领域30

5、多年的研究成果,为我们开展地贫产前诊断提供了以下几个方面的相关研究根底:(1)基因定位、基因调控和分子病理学根底研究:研究说明了导致和地贫的和珠蛋白基因的染色体定位、基因突变及其功能异常与发病的关系;以及血液学和临床表型的变化规律及其与基因型的关系。(2)遗传流行病学和基因突变谱鉴定:研究说明了地贫的地域分布特征、人群中基因突变谱的种族差异,以及不同高发区的人群基因频率和遗传负荷。(3)分子诊断技术的建立和开展:建立了和地贫等的基因缺失和点突变的DNA诊断技术,使DNA诊断技术成为产前诊断的主流技术。此外,其他一些根据遗传表型进行疾病诊断的技术,如胎儿脐带血分析和胎儿心胸比值超声检测也被应用于

6、地贫Hb Ba胎儿水肿综合征的产前诊断中。 我国在该领域的相关根底研究和临床产前诊断起步于20世纪70年代后期,在80年代中期完成了全国20个省市(自治区)的万人的大规模Hb病的调查及其局部基因缺陷的分析,得出了中国南方是地贫高发区的结论。曾溢滔、吴冠芸和张基增等最早说明了中国人和地贫的基因突变谱,并于1984年和1986年先后成功地完成了我国和地贫高风险患儿的产前基因诊断。对和地贫的产前基因成功诊断代表了我国医学领域最早采用现代遗传学技术的应用成果之一。自20世纪9O年代以来,我国在该领域的研究主要集中在我国南方高发区人群的分子流行病学、中间型地贫及导致该病少见类型突变基因的鉴定、分子诊断新

7、技术的研发及其在人群预防中的应用,这些研究对推动我国南方高发区地贫的临床诊断和人群预防奠定了坚实的根底。 二、产前诊断地贫技术的应用及其现状 如前所述,地贫分子根底和人群特异性基因突变谱确实定,为地贫的临床病例确诊和产前诊断奠定了理论根底。用于临床实验室进行病例确诊和产前诊断所需要的分子诊断技术随后应运而生,从1976年至今,针对绒毛和羊水细胞中DNA分子诊断技术应用于地贫的产前诊断已经积累了35年的经验,期间分子诊断技术不断开展和变化。目前,应用的主流技术都是基于PCR技术根底上的基因突变分析技术,可以说现代分子诊断技术广泛应用于产前诊断,完全受益于简便、快速和经济的PCR技术的普及。目前,

8、用于地贫产前诊断的代表性技术大体可分为以下两类:检测基因缺失突变的单管多重跨越断裂点PCR技术和多重连接探针扩增技术(MLPA);检测基因点突变的反向点杂交技术(RDB)、变性高效液相色谱技术(dHPLC)和DNA序列分析技术等。此外,最近开展的基于实时荧光PCR平台的新技术,如用于地贫缺失拷贝数定量的实时荧光PCR直接检测技术、以及用于检测地贫点突变的基于探针熔解曲线的基因分型技术(PMCA),可能是下一步更新换代的技术选择。上述胛p PCR、RDB和MLPA等为地贫检测的主流技术,目前,国内外已有和地贫分子诊断商品化的检测试剂盒问世。 上述分子诊断技术主要用于临床病例确诊,以及以预防为目的

9、的分子水平的筛查和高风险胎儿的产前诊断。DNA突变分析是包括诊断地贫在内的单基因遗传性疾病的“权威性信息,通过对患者DNA的和珠蛋白基因的突变及其基因型进行分析,可以完成绝大多数和地贫患者的临床确诊,并可根据基因型检测结果进行临床分类、准确预测其病程和预后G但由于局部中间型地贫的基因缺陷比拟复杂,尚不能根据基因型检测结果预测其临床表现和病程开展。在地贫的产前诊断实际工作中,分子筛查的应用是近年来不可无视的重要方面,其主要应用对象是静止型地贫,由于传统的血液学筛查不能发现静止型地贫的阳性表型,故应用分子诊断技术直接检测这类基因携带者是不可替代的技术选择。以广西为例,通过分子诊断技术可以发现人群中

10、7.%的静止型地贫基因携带者,这对于当地人群高风险家庭的遗传负荷评估十分必要。在产前诊断的医学实践中,目前有两种应用对象,一是回忆性产前诊断,即针对已经生育过重型地贫患儿的家庭,再次妊娠时进行产前诊断,这是目前欠兴旺国家和地区的主要操作方式,我国的情况也大致如此;二是前瞻性产前诊断,即通过对高发区人群的大规模筛查主动发现地贫高风险家庭,进一步通过遗传咨询开展产前诊断,从而到达降低重型地贫患儿出生的目的。由于同型地贫携带者婚配的下一代有的时机罹患中间型或重型地贫,因而地贫患儿的出生是严重影响高发区人口质量的公共健康问题。从20世纪70年代末至今,以降低人群重型地贫患儿出生率为目标的大规模人群筛查

11、和产前诊断方案,已在地中海地区等一些国家进行了成功的实践,取得了世人瞩目的疾病预防效果。我国从1993年开始,一些医院开展了前瞻性的地贫预防模式研究,并于1998年开始,在珠海等地区探索了在社区根底上的大规模人群预防方案实施的试点,积累了一些珍贵的经验。在国家卫生部推动下,我国地贫发病率最高的广西壮族自治区,已经于2021年开始启动了大规模人群预防方案,其目标是通过5年的努力使全区的重型地贫患儿出生率大幅度下降。这一方案以及在广东省一些地区开展的类似方案,是今后我国地贫等遗传病产前诊断领域的开展方向。 三、对地贫研究的展望 地贫是世界上最早被说明分子根底水平,又是最先应用分子诊断技术实现产前诊

12、断的人类遗传性疾病,由于通过产前诊断可以到达阻止患儿出生的目的,地贫也是WHO优先推荐在开展中国家实施预防的遗传性疾病。通过绒毛、羊水和脐带血的创伤性取样技术与DNA诊断的结合,进行产前诊断已成为包括中国在内的许多开展中国家的常规实验室遗传效劳工程。尽管如此,为克服创伤性诊断给孕妇带来的流产风险和穿刺引起的负面心理影响,无创性产前诊断和植入前遗传诊断(PGD)是国内外近20多年以来一直致力于开展的研究领域261,在这些研究中,地贫又成为重要的研究和临床应用对象,其中一些通过对孕妇血浆中胎儿DNA进行或地贫的无创性产前诊断技术已经出现,特别是该领域最近引入的新一代测序技术(NGs)和单分子PCR

13、定量检测技术,将对解决和地贫这类单基因病的无创性产前诊断的技术难题起关键作用,可能是未来10年最值得期待的临床应用技术方案。目前,PGD技术已成功应用于包括和地贫在内的单基因遗传性疾病的胚胎遗传诊断3032,我国学者也开展了类似的研究工作L3334J。总体上看,针对地贫的PGD技术较孕妇血浆中胎儿DNA检测的无创性产前诊断更为成熟一些,经过技术改良和提高,地贫的PGD成为临床常规检测工程将有广阔的应用前景。 我国南方地区是全球地贫高发区之一,由于我国地贫高发区涉及的人口多、地域广,因此,这一疾病防治对于提高我国南方地贫高发区人民的健康水平和人口质量具有重要意义。我国在该领域的研究以及临床和预防

14、医学实践中,还有以下一些重要问题需要面对和解决:(1)一些主要高发区,如福建、云南、海南、贵州、四川等省仍然缺乏详实、准确的遗传流行病学调查资料,通过整体设计、应用新技术开展包括这些地区在内的中国南方地贫高发区的疾病谱的调查十分必要,也是当前首先需要实施的研究任务。这一重要遗传病在世界各种族人群中的基因频率和突变谱调查,仍然是该领域面临的重要课题:(2)中国人群在地贫分子水平的根底研究尚需加强,特别是中间型地贫的遗传异质性和相关遗传修饰基因的研究,需紧跟国际前沿,利用本民族的地贫资料开展发病机制的原创性研究,其中胎儿Hb调节机制在地贫发病中的作用,是值得关注的重要研究靶点,这一课题研究有赖于联合高发区多家医院大样本、多中心合作才能完成。(3)继续开展适合我国人群的分子诊断新技术的研发,特别是开展可满足大规模人群筛查所需要的简单、快速、高通量的分子诊断技术尤为重要,这类技术的应用可为提升我国地贫的整体防治水平提供技术支撑。同时,分子诊断技术也是制定适合我国国情的地贫分型和诊治标准的根底。(4)推动以降低重症地贫患儿出