实验诊断学：乙肝两对半检查实验

1、临床免疫学检查临床免疫学检查（乙肝两对半检测）乙肝两对半检测） 【实验内容实验内容】ELISA法检测乙型肝炎病毒标志物：法检测乙型肝炎病毒标志物：1. 乙型肝炎病毒表面抗原（乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）2. 乙型肝炎病毒表面抗体（抗乙型肝炎病毒表面抗体（抗HBs、HBsAb）3. 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e抗原（抗原（HBeAg）4. 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e抗体（抗抗体（抗HBe、HBeAb）5. 乙型肝炎病毒核心抗体（抗乙型肝炎病毒核心抗体（抗HBc、HBcAb） 【实验实验原理原理】l酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA） 一种固相酶免疫测定技术：先将抗体或抗

2、原包被一种固相酶免疫测定技术：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，与待测样品中的抗原或抗体发到某种固相载体表面，与待测样品中的抗原或抗体发生反应，再加入酶标抗体或抗原与免疫复合物结合，生反应，再加入酶标抗体或抗原与免疫复合物结合，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度（及其吸光度（A A）值的大小进行定性或定量分析）值的大小进行定性或定量分析。ELISAELISA检测类型检测类型l双抗体夹心法双抗体夹心法l双位点一步法双位点一步法 HBsAg HBeAgl间接法间接法 HBsAbl竞争法竞争法 HBeAb、HBcAbl捕获法捕获

3、法双抗体夹心法双抗体夹心法 检测示意图检测示意图 孵育30min后，充分洗板双位点一步法双位点一步法 检测示意图检测示意图 抗原过多，可能出现抗原过多，可能出现后带现象，假阴性后带现象，假阴性间接法间接法 检测示意图检测示意图竞争法竞争法 检测示意图检测示意图 如何读取结果？如何读取结果？乙型肝炎病毒诊断试剂盒组成乙型肝炎病毒诊断试剂盒组成 微孔反应板微孔反应板 4 4孔孔酶结合物酶结合物 1 1瓶瓶阳性对照阳性对照 1 1瓶瓶 阴性对照阴性对照 1 1瓶瓶 显色剂显色剂A 1A 1瓶瓶 显色剂显色剂B 1B 1瓶瓶洗涤液洗涤液 1 1大瓶大瓶操作步骤操作步骤1.1.加样：加样： 标本标本50

4、ul50ul 空白对照空白对照 阴性对照阴性对照1 1滴滴 四个酶标孔内四个酶标孔内 阳性对照阳性对照1 1滴滴注：注：HBcAb-HBcAb-待测标本用生理盐水作待测标本用生理盐水作1 13030稀释稀释 （50ul50ul标本标本+1.5ml+1.5ml生理盐水）生理盐水）2.2.加酶结合物加酶结合物：除空白对照孔外，每孔加入酶结合物：除空白对照孔外，每孔加入酶结合物1 1滴，滴，充分混匀，置充分混匀，置3737孵育孵育3030分钟。分钟。操作步骤操作步骤3.3.洗板洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5 5秒，甩干，重复秒，甩干，重复5 5次后拍干

5、。次后拍干。4.4.显色显色：每孔加显色剂：每孔加显色剂A A液、液、B B液各液各1 1滴，充分混滴，充分混匀，置匀，置3737孵育孵育1010分钟。分钟。5.5.结果观察结果观察：有无显色反应。：有无显色反应。结果判读结果判读l显色反应呈显色反应呈蓝色蓝色l肉眼判读：肉眼判读： HBsAg HBsAb HBeAgHBsAg HBsAb HBeAg蓝色为阳性蓝色为阳性，无色为阴性。无色为阴性。lHBeAbHBeAb和和 HBcAbHBcAb测定时，由于采用竞争法，所测定时，由于采用竞争法，所以判断结果时刚好相反，无色为阳性，以判断结果时刚好相反，无色为阳性，蓝色为蓝色为阴性阴性。结果报告结果

6、报告lHBsAgHBsAg: 阴性（阴性（阳性阳性）lHBsAbHBsAb: 阴性（阴性（阳性阳性）lHBeAgHBeAg: 阴性（阴性（阳性阳性）lHBeAbHBeAb: 阴性（阴性（阳性阳性）lHBcAbHBcAb: 阴性（阴性（阳性阳性）注意事项注意事项lHBcAbHBcAb测定：待测标本稀释后的检测结果为临测定：待测标本稀释后的检测结果为临床意义；不作稀释的检测结果为流行病学意义。床意义；不作稀释的检测结果为流行病学意义。l竞争法判断结果时要注意。竞争法判断结果时要注意。l冷藏环境中取出的试剂盒及标本使用前应置室冷藏环境中取出的试剂盒及标本使用前应置室温平衡温平衡3030分钟后才可测定

7、。分钟后才可测定。l使用前试剂应摇匀，并弃去使用前试剂应摇匀，并弃去1 1滴后垂直滴加。滴后垂直滴加。l结果判断需在反应终止后结果判断需在反应终止后1010分钟内完成。分钟内完成。我国HBV感染概况l一般人群一般人群HBsAg携带率高达携带率高达7.18%；现有慢性；现有慢性HBV感染者约感染者约9 300万人万人，占全世界的，占全世界的1/4；l其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过 2 000万例，占全世界慢性乙万例，占全世界慢性乙肝患者的肝患者的1/3；l15岁以下儿童岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，携带率下降显著，1-4岁组仅为岁组仅为0.96%；1 4岁组岁

8、组HBsAb阳性率由阳性率由1992年年15.75%升至升至72.25%; 抗抗HBcAb阳阳性率由性率由1992年年30.08%降至降至3.76%15乙型肝炎病毒病毒标志物检测乙型肝炎病毒病毒标志物检测乙型肝炎乙型肝炎表面抗原（表面抗原（HBsAgHBsAg）乙肝病毒前乙肝病毒前S1S1抗原抗原抗乙肝病毒前抗乙肝病毒前S1S1抗体抗体乙肝病毒前乙肝病毒前S2S2抗原抗原抗乙肝病毒前抗乙肝病毒前S2S2抗体抗体 乙型肝炎核心抗原（乙型肝炎核心抗原（HBcAgHBcAg） 乙肝乙肝核心抗体（抗核心抗体（抗-HBc-HBc）乙型肝炎乙型肝炎表面抗体（抗表面抗体（抗-HBs-HBs）乙型肝炎乙型肝炎

9、e e抗原（抗原（HBeAgHBeAg）乙型肝炎乙型肝炎e e抗体（抗抗体（抗-HBe -HBe ）乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DNADNAl1 1）最常用的检测项目）最常用的检测项目 两对半两对半 测定方法：测定方法：ELISAELISA、放射免疫法（、放射免疫法（RIARIA）、）、发光免疫法发光免疫法( (定量定量) ) 2 2）乙肝）乙肝DNADNA定量定量PCRPCR检测检测 病毒复制、诊断依据、传染性、疗效监测等病毒复制、诊断依据、传染性、疗效监测等乙型肝炎病毒病毒标志物检测乙型肝炎病毒病毒标志物检测 乙肝两对半乙肝两对半lHBsAgHBsAg（表面抗原）：（表面抗原）： 存在于存在于

10、DaneDane颗粒的表面的糖蛋白。颗粒的表面的糖蛋白。判断判断HBVHBV感染的指感染的指标之一标之一 ，阳性见于急性乙肝的潜伏期，发病时达高峰，如果发病后阳性见于急性乙肝的潜伏期，发病时达高峰，如果发病后3 3个月不个月不转阴，则易发展成慢性乙型肝炎。转阴，则易发展成慢性乙型肝炎。l抗抗-HBs-HBs（表面抗体）：（表面抗体）：是一种是一种保护性抗体保护性抗体，可阻止，可阻止HBVHBV穿过细胞膜进入新的穿过细胞膜进入新的肝细胞，提示机体对乙肝病毒有一定程度的免疫力。是机体感染或接种乙肝肝细胞，提示机体对乙肝病毒有一定程度的免疫力。是机体感染或接种乙肝疫苗的标志。疫苗的标志。lHBeAg

11、HBeAg（e e抗原）：抗原）：其阳性是乙型肝炎的重要标志，提示病毒其阳性是乙型肝炎的重要标志，提示病毒活动性活动性较强，较强，传传染性较大染性较大。持续阳性，表明肝细胞损害较重。持续阳性，表明肝细胞损害较重。l抗抗-HBe-HBe（e e抗体）：抗体）：抗抗-HBe-HBe的出现意味着大部分的出现意味着大部分HBVHBV被消除，复制减少，传染被消除，复制减少，传染性降低，但并非无感染。性降低，但并非无感染。l抗抗-HBc-HBc（核心抗体）：（核心抗体）：反映肝细胞受到反映肝细胞受到HBVHBV侵害的一种指标，阳性表示正在侵害的一种指标，阳性表示正在感染或既往感染。感染或既往感染。 lHBcAg(核心抗原核心抗原)： 是乙肝病