叶绿素的提取与含量测定

1、才巧y丿叨实验报告课程名称：植物生理学实验指导老师：成绩:实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验类型同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）三、实验材料与试剂（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）七、实验结果与分析（必填）二、实验内容和原理（必填）四、实验器材与仪器（必填）六、实验数据记录和处理八、讨论、心得一、实验目的和要求：1. 掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定。2. 掌握定量分析的原理和方法。二、实验内容和原理：以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：1. 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%

2、的乙醇或80%的丙 酮提取。2. 皂化反应。叶绿素是二拨酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。3. 取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素吓咻环中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。4. 叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。5. 定量分析。叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a, b及总量，而652可直接用于总量分析。三、实验材料与试剂材料：青菜叶试剂：KOH固体、醋酸铜粉末、醋酸四、主要仪器设备：1. 天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机2. 研具

3、、PE管、酒精灯等五、操作方法和实验步骤（必填）1. 定性分析：荧光现象：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml （逐步加入），磨成匀浆,过滤入三角瓶, 观察荧光现象皂化反应：加KOH数片剧烈摇均，加石油瞇lml和H:0 lml,分层后观察取代反应：加醋酸约lml,观察颜色，取1/2加醋酸铜粉，加热变 亮绿 色2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：皂化反应的上层黄色石油醸溶液（稀释470nm 0D ）,在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素的吸收峰反复用石油瞇粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素（盐），（稀释663nm0D ）,分别测定叶绿素的吸收峰3 叶绿素定量分析：鲜叶，力口，磨成

4、匀浆，取2份加80%丙酮,摇匀，4000转离心3min,上清液在645, 652, 663测定OD,计算Chia, Chib和Chi总量的値。六. 实验数据记录和处理1.荧光现象：透射光绿色，反射光 红光2皂化反应：上层呈黄色,为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色。为叶绿素。吸收蓝紫光和红光。皂化反应分层3. 类胡萝卜素和叶绿素的吸收光谱测定:上层黄色溶液扫描光谱吸收峰为 468nm> 439nm 413nm> 667nm 和 606nm 五个 下层绿色溶液扫描光谱去镁叶绿素铜代叶绿吸收峰为414nm> 526nm、639nm三个4. 取代反应:加醋酸约lml,变褐（去镁 叶

5、绿素） 取1/2加醋酸铜粉加热变亮绿色,为铜代叶绿素。素5. 叶绿素含量测定波长/nm吸光度（第一组）吸光度（第二组）645652663根据公式：CagL二 0D645Cksb/L>= 0D652? 1000/Chia 含量（mg/二（ca（a,.1）/1000）?2/ ?5/Chib 含量（mg/ =（Ct/1000） ?2/ ?5/Chi总含量（mg/ =（Ct）/1000）?2/ ?E求得：C&产 mg/ LC&2二 nig/ LCb 产 mg/ LCb：= mg/LCn= mg/LCt： mg/LChia 含量 1 = mg/Chia 含量 1 = mg/Chib

6、 含量 1 = mg/Chib 含量 1= mg/Chi总含量1= mg/Chi总含量1= mg/七、实验结果与分析类胡萝卜素和叶绿素的吸收光谱测定：类胡萝卜素的吸收峰为蓝紫光区468nm> 439nm、413nm三个峰，在红光区667nm和606nm的峰说明叶绿素有残留。叶绿素在蓝紫光区有414nm、526nm两个峰，在红光区有639nm 个峰，蓝紫光区的 峰比红光区的高，说明叶绿素吸收蓝紫光的能力比红光强。叶绿素含量测定：Chia 含量 1 = mg/ Chia 含量 1 = mg/Chib 含量 1 = mg/ Chib 含量 1= mg/Chi总含量1= mg/ Chi总含量1=

7、 mg/两组测定结果中叶绿素a与叶绿素b含量之和与用663nm求得的总叶绿素含量比较 接近，说明实验结果较为理想，可能造成实验误差的因素有：1. 研磨后的叶绿素溶液中仍存在固体，可能堵塞移液枪管口，造成吸入的溶液量不准确2. 比色皿未清洗干净，造成测得的吸光度改变3. 分光光度计存在仪器误差八、讨论、心得思考题：1. 为什么叶绿素吸收红光和蓝紫紫光叶绿素的能级有基态（G）,第一单线激发态（E1）,第二单线激发态（E2）和三 线激发态（E3）,光子吸收必须遵守普朗克定律，被吸收光子的能量必须等于基态和 激发态的能量差。蓝紫光能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到E2,而红光能量 小，只能使其跃迁到E1,故叶绿素只能吸收蓝紫光和红光。2. 为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱因为由于叶绿素皂化反应后的叶绿素盐并不影响叶绿素分子的骨架结构，叶绿 素对光的吸收规律与叶绿素盐对光的吸收规律儿乎是相同的，而且皂化反应可以从 叶绿体色素中只筛选出叶绿素，排除了其他色素的干扰，所以可用皂化后的叶绿素 盐来测定叶绿素的吸收光谱。讨论:1皂化反应后的黄色溶液需用石油瞇萃取多次，如果萃取补充分，会有叶绿素残留， 在扫描吸收光谱时除了在468nm、439nm、413