RGD肽修饰壳聚糖作为种植体表面基因载体的研究综述

1、RGD肽修饰壳聚糖作为种植体表面基因载体的研究综述随着社会经济的发展以及口腔修复意识的进步， 现在越来越多的患 者选择种植修复缺失牙，而骨量不足患者的种植修复因风险大而成为 学者们研究的重点。种植体表面处理的目的是为了促进成骨细胞在种 植体表面更好地成骨1。目前国内外学者着力于研究种植体的不同表 面处理方法，如小分子靶向肽修饰壳聚糖作为基因载体、金属钛表面 接枝短肽促进成骨细胞的附着与成骨2等。RGD肽是一类含有精氨酸 —甘氨酸—天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp)序列的短肽，广泛存在于生物体内，可与 11种整合 素特异性结合，促进成骨细胞生长，抑制破骨

2、细胞之间及破骨细胞与 基质之间的黏附，从而促进骨组织再生3。将RGD肽组装到种植体 表面，能明显促进种植体周围的新骨形成，增加种植体固位力。种植 体表面RGD组装方法对其在种植体表面上的应用以及种植体骨整合 均有一定的影响。改善 RGD肽在种植体表面的固定方法是近年来学 者们研究的热点4。壳聚糖(chitosan, C0是一种新型的非病毒基因载体材料，与 机体的生物相容性好，可生物降解，能有效地浓缩质粒DNA(plasmid DNA, pDNA),同时其表面带有的阳离子还可以和带有阴离子的DNA有效地结合，从而保护DNA免受DNA酶(DNasel)的降解5。此外， CS具有强的生物黏附作用，毒

3、副作用小，来源丰富，价格低廉，作 为非病毒性基因载体具有独特的优势。 但是，壳聚糖的低靶向性和低 转染效率限制了其临床应用6。为了提高壳聚糖的靶向性以及转染效率，本研究拟在壳聚糖分子上进行短肽修饰，然后包裹pDNA,形成RGDCS/pDNA复合体，通过钛表面层层自组装以及化学偶联的方法将 复合体接枝到种植体表面，以达到提高种植体植入后成骨效率的目的。1材料和方法1.1 主要材料和设备CS （分子质量5.0×104,脱乙酰度大于等于 90%,浙江金 壳生物化学有限公司），1- （3-二甲基氨基丙基）-3乙基碳化二亚胺 盐酸盐1-（ 3-Dimethylamino propyl

4、） -3-ethylcarbodiimide hydrochloride , EDC·HCl（上海共价化学科技有限公司），N羟基琥珀酰亚胺 （N-Hydroxysuccinimide, NHS）（上海延长生化科技发展有限公司）， RGD肽（无锡亚肽生物科技有限公司），pDNA （华南农业大学资源环 境学院），琼脂糖（上海赛百盛基因技术有限公司），上样缓冲液（loading buffer） （TaKaR公司，日本），DNaseI（TaKaR公司，日本）， 纯钛板（宝鸡三线有色金属材料厂）。FT-IT Nicolet Impact 410 型红外光谱仪（Nicolet 公司，

5、美国）， Elementar Vario EL I元素分析测定仪（Elementar公司，德国）， BGpower 600电泳仪（北京百晶生物技术有限公司），GelDoc IT TS2 凝胶成像分析系统（UVP公司，美国），Nanoacope原子力显微镜 （atomic force microscope, AFM） （Veeco公司，美国），透析袋（MWCO 3500,上海绿鸟科技发展有限公司）。1.2 钛表面物理、生化处理7将商业纯钛片切割成方形试样，表面喷砂粗化后行烧结处理，然 后进行混合酸液（98%H2SO4： 30%H2O2为1 ： 1）酸洗2 min,丙酮、 无水乙醇、双蒸水依次超声

6、清洗15 min,干燥。80 I 5 mo l·L-1 NaOH溶液羟化毕业论文网专业提供代写论文的服务 www. dylw.nE T欢迎光临处理24 h, 80双蒸水陈化24 h,双蒸水冲洗，干燥。钛 酸四正丁酯（C16H36TiO4）与异丙醇1 : 3混合，剧烈搅拌（60 I, 4 h）,制备纳米级TiO2溶胶。羟化后纯钛浸润于溶胶反应 10 min, 无水乙醇超声清洗，双蒸水再羟化 1 min,干燥。重复3次。反应如 图1。1.3 RG曲枝 CS形成 RGDCS81.3.1 酰化反应偶联RGDW CS形成RGDCS称取RGD太20.0 mg, 用 1%HAGNaAc

7、缓冲液（pH 6.0） 2 mL溶解。加入 EDC·HCl 100 mg, NHS 50 mg在4不磁力搅拌，活化12 h。称取相对分子质量 为50×103的CS 20 mg容于适量1%HAc溶液中，搅拌溶解。用 1%NaOH溶液调节pH至6.0,得到黄色澄清溶液。在搅拌下，缓慢滴 入活化的RGD溶液中。4不继续搅拌24 ho将反应液转移至透析袋 中，用去离子水透析3 d,每12 h更换一次透析液。透析完毕后，产 物冻干待用。反应如图1。1.3.2 RGOCS化学结构的表征检测 采用红外光谱仪对RGDCS进 行红外光谱检测（KBr压片法），元素分析仪对

8、 CS RGD RGDCS 3 种样品中元素C、H、N的含量进行测定。1.4 RGE3CS包装 pDNA1.4.1 复凝聚法制备 RGDCS/pDNAg合体 称取RGDCS 10.0 mg 溶于 0.2 mol·L-1 HAc-NaAc缓冲液（pH 5.0） 10 mL 中，配制 成质量浓度为1 mg·mL-1的RGDCS容液。将pDNA配制成0.1 mg·mL-1的溶液。在每一部分实验中，保持每个样品中加入 的DNA的质量一定，按照不同的N/P （阳离子载体中的氮原子与 DNA 的磷原子的摩尔比例）加入一定量的 RGDCS溶液

9、，N/P为0、1、2、 5、10、20、50。采用 0.2 mol·L-1 HAc-NaAc缓冲?夜（pH 5.0） 将复合体溶液定容至相同体积。分别取 RGDCS溶液与骨形态发生蛋 白（bone morphogenetic protein , BMP） 2 质粒溶液在 55 冰浴预热 10 min,迅速将二者混合，通过涡旋仪混匀 1 min,将混合物在室温 下放置30 min,即得RGDCS/pDNA复合体。反应如图1。以不经RGD 修饰的CS作为对照，在同样条件下，合成 CS/pDNA复合体。1.4.2 凝胶电泳阻滞试验检测 RGDCS对质粒的包裹情况 选取不 同N/

10、P比制备样品，取 16 μL RGDCS/BMP2复合体与4 μL Loading Buffer混合，在120 mV电压下电泳30 min。紫外灯下观察 RGDCS对质粒的包裹情况。1.4.3 AFM观察RGDCS/pDNA复合体 取RGDCS/pDNA复合体固 定于云母片上，在轻敲模式下用AFM观察其形态，轻敲频率37 kHz, 扫描速度1.00 Hz,扫描范围5 μm×5 μm （粗略扫描） 或 2 μm×2 μm （精细扫描）。1.5 RG3CS/pDNA复合体接枝钛片1.5.1 RGDCS/pDNA复合体接枝钛片的制备将钛酸四正丁酯（C16H36TiO4与异丙醇以1 : 3的体积比混合，剧烈搅拌（6