高效液相色谱法简介

1、1 主讲：郑萍主讲：郑萍 高级工程师，高级工程师， 执业药师执业药师化学化工学院化学化工学院2 液相色谱分析是在经典的液体柱色液相色谱分析是在经典的液体柱色谱基础上，引入了气相色谱的理论；在谱基础上，引入了气相色谱的理论；在技术上采用了技术上采用了高压泵、高效固定相和高高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种柱色谱技离效率高和操作自动化，这种柱色谱技术被称做高效液相色谱法。术被称做高效液相色谱法。3慢慢中等中等快快Temporal course淋洗液淋洗液4 叶绿素的柱色谱叶绿素的柱色谱5三组分混合物的分离三组分混合物

2、的分离6在在C18C18柱中，三组分混合物流出色谱柱中，三组分混合物流出色谱柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。 当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中子结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中存在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合存在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配系数有关：系数有关： K K =

3、= 化合物在固定相中的浓度化合物在固定相中的浓度C C固固 化合物在流动相中的浓度化合物在流动相中的浓度C C流流 K K值小，先流出柱子，值小，先流出柱子，K K值大的，保留作用强，后值大的，保留作用强，后流出柱子。流出柱子。78 键合相键合相-反相色谱反相色谱91. 概 述色谱法：色谱法：(chromatography)(chromatography)： 以试样组分在固定相和流动相间的溶解、以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。色谱法

4、。几个概念几个概念色谱柱：进行色谱分离用的细长管。色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：管内保持固定相：管内保持固定、起分离固定、起分离作用的填充物。作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。101-4 1-4 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点一一 高压高压 液相色谱以液体作为流动相（液相色谱以液体作为流动相（称为载液称为载液），），液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。在迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。在现代液体色谱中供液压力和进样压力都很高，现

5、代液体色谱中供液压力和进样压力都很高，一般可达到一般可达到150300kgcm2，甚至可达，甚至可达700kcm2以上。以上。11二二 高速高速 高效液相色谱所需的分析时间较之经高效液相色谱所需的分析时间较之经典液体色谱快得多，一般可达典液体色谱快得多，一般可达l10mLmin， 个别可高达个别可高达100mLmin以上，这以上，这已近似于气相色谱的流速。已近似于气相色谱的流速。 三三 高效高效 气相色谱的分离效能很高，高效液相气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达色谱的柱效则更高，一般约可达 60000理理论塔板米论塔板米；12四四 高灵敏度高灵敏度 紫外检测器的最紫外

6、检测器的最小检小检测量可达测量可达毫微克毫微克数量级数量级(10-9 g)；荧光检测器的灵敏度可达；荧光检测器的灵敏度可达10-11g。高效液相色谱的高灵敏度还表现在。高效液相色谱的高灵敏度还表现在所需试样很少；微升数量级的样品就足以所需试样很少；微升数量级的样品就足以进行全分析。进行全分析。 131-5 1-5 高效液相色谱流程和设备高效液相色谱流程和设备 高效液相色谱仪一般可分为高效液相色谱仪一般可分为5 5个主要部分：个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。统。此外还配有此外还配有辅助装置辅助装置：如梯度淋洗，自动：如梯度淋洗，自动

7、进样及进样及数据处理数据处理等。其工作过程如下：等。其工作过程如下： 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 1415样品吸收度测定吸收池示图16紫外检测器工作原理紫外检测器

8、工作原理1718 废废液液样样品品 淋洗液淋洗液 至分离柱至分离柱进样阀进样阀 样样品品 废废液液 淋洗液淋洗液至分离柱至分离柱 定量定量（）（）（）（） 样样品品环环19液相色谱动画演示液相色谱动画演示20二、色谱图二、色谱图 试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号信号时间曲线或信号时间曲线或信号流动相体积曲线，流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图称为色谱流出曲线，或色谱图

9、。如图12-212-2常用术语：常用术语：1. 1. 基线基线 : : 在操作条件下，仅有在操作条件下，仅有纯流动相纯流动相进入进入检测器时的流出曲线。检测器时的流出曲线。212. 2. 色谱峰色谱峰: : 当组分随流动相进入检测当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小随时间变化所形器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布布。. .峰高与峰面积峰高与峰面积峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高离称为峰高(peak height)(peak height)。用。用h h表示。表示。峰面积：峰

10、与峰底之间的面积称为峰面峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积积(peak area)(peak area)，用，用A A表示。表示。2221 保保 留留 值值 一、保留时间（一、保留时间（tR） 从进样开始到柱后出现样品的浓度极大从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用值所需的时间为保留时间，用tR表示。表示。232-2 2-2 色谱柱的分离效率及柱效能的评价色谱柱的分离效率及柱效能的评价 一、塔板理论一、塔板理论 塔板理论认为，一根柱子可以分为塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理

11、论塔板。设柱长为一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔，理论塔板高度为板高度为H，则，则 H=L/n式中式中n为理论塔板数。为理论塔板数。24 色谱柱的分离效率（简称柱效），色谱柱的分离效率（简称柱效），可定量地用理论塔板数可定量地用理论塔板数N来表示。来表示。 理论塔板数一理论塔板数一N还与柱长有关，当还与柱长有关，当比较两不同长度的色谱柱的柱效时，比较两不同长度的色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的应当比较它们在相同柱长下的V值。值。25 可用半峰高处的峰宽可用半峰高处的峰宽(半峰宽）和保留时间半峰宽）和保留时间的关系来表示理论塔板数的关系来表示理论塔板数N，这时关系式为：，这时关

12、系式为： N554 ( tR / Wt1/2 ) 2 2式中式中： Wt1/2 -半峰宽半峰宽例如，从图例如，从图2-3，测得，测得tR=105mm、 Wt1/2 =4mm，求得求得N=3789，若此柱长为，若此柱长为250mm,折成每米的理论折成每米的理论塔板数约为塔板数约为15200. 262-3 分离度及影响因素分离度及影响因素一一 分离度（分辨率分离度（分辨率) 研究色谱中有关分离问题时，首先就研究色谱中有关分离问题时，首先就是要能定量地确定相邻两峰的分离程度。是要能定量地确定相邻两峰的分离程度。 从图从图8-3可以看出，为了获得较好的分可以看出，为了获得较好的分离，就离，就必须使最大

13、峰值之间的距离增加，必须使最大峰值之间的距离增加，峰宽减小。峰宽减小。2728 一般用一般用Rs来定量表达相邻两峰的分离来定量表达相邻两峰的分离程度，所以程度，所以Rs是色谱中两个组分分离好坏是色谱中两个组分分离好坏程度的标志。要求程度的标志。要求RS1.5 tR1 tR2 Rs = 1/2(W1+W2) 式中式中 tR1、tR2 分别为两组分的保留时间，分别为两组分的保留时间， W1 、W2为色谱峰的峰底宽度为色谱峰的峰底宽度 . 295 5 高效液相色谱的定性和定量分析高效液相色谱的定性和定量分析 5-1 5-1 定性分析定性分析 在液相色谱中保留值定性的方法主要是用在液相色谱中保留值定性

14、的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（保留值（t Rt R或或V R V R ）与某一已知标准）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。认定未知峰与标准物是同一物质。 305-2 5-2 定量分析定量分析 HPLC色谱定量的基本方法

15、有色谱定量的基本方法有内标内标法、外标法等。法、外标法等。 外标法外标法标准曲线法标准曲线法 是一种简便、快速的是一种简便、快速的绝对绝对定量方定量方法（归一化法则是法（归一化法则是相对相对定量方法）。定量方法）。首先用欲测组分的标准样品绘制标首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线准工作曲线。31具体作法是具体作法是： 用标准样品配制成不同浓度的标用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此

16、标准样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。工作曲线应是通过原点的直线。若标若标准工作曲线不通过原点，说明测定方准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。率即为绝对校正因子。32 目前已普及于几乎所有重要的分析学科目前已普及于几乎所有重要的分析学科领域和许多科研生产部门，高效液相色谱能领域和许多科研生产部门，高效液相色谱能较理想地分离和分析与生物医学有关的大分较理想地分离和分析与生物医学有关的大分子和离子型物质，易变质的天然产物，各种子和离子型物质，易变质的天然产物，各种高分子化合物和不稳定化合物。高分子化合物和不稳定化合物。 例如例如：蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面活性剂、农药、甾