结直肠癌治疗综述

1、结直肠癌靶向治疗分子靶标检测的临床实践规范摘要：前言：结直肠癌(colorectal cancer, CRC ) 是世界范围内的常见恶性肿瘤之一。根据最新的世界卫生组织统计数字表明，结直肠癌属高危害消化道恶性肿瘤，仅次于肺癌、胃癌，其发病率已占到常见恶性肿瘤的第三位。近年来，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势，在中国结肠癌的发病率每年以4.2%的速度上升，为世界平均增长速度的两倍，2010年中国新增结直肠癌患者达40万。目前结直肠癌的治疗是以手术、放疗、化疗和靶向治疗为主的综合治疗。近年来，靶向治疗及相关转化性研

2、究受到关注。美国临床肿瘤学会(ASCO)评出的6项有关结直肠癌研究的最重要的研究进展和成果中，有5项与靶向治疗相关。因此，结直肠癌诊治实际已经步入了“分子分型”和“靶向治疗”时代，尤其是KRAS-BRAF基因检测占据了举足轻重的地位。2009年NCCN结/直肠癌临床实践指南更新推荐，对晚期结直肠癌患者应检测其KRAS基因状态，并把使用抗EGFR单克隆抗体治疗的指征严格限定为KRAS基因野生型患者。2010年NCCN结直肠癌临床实践指南则建议应对KRAS基因野生型患者进一步检测BRAF基因(V600E)突变情况，认为BRAF基因突变者似不能从抗EGFR单克隆抗体治疗中获益。目前一些回顾性研究表明

3、，无论BRAF(V600E)突变与否，在转移性结直肠癌的一线治疗中，抗EGFR单克隆抗体联合有效化疗似均能使患者获益。但对于一线治疗后进展的转移性结直肠癌患者，尚无充分研究资料表明BRAF(V600E)突变者接受抗EGFR单克隆抗体治疗是无反应的。因此，由于缺少前瞻性研究的有力支持，2011版NCCN结/直肠癌临床实践指南仍建议检测KRAS-BRAF基因状态。目前临床资料显示，超过50%的结直肠癌会出现肝转移，而这些肝转移灶无法切除的病人预后较差。化疗联合以西妥昔单抗为代表的分子靶向药物能明显提高化疗反应率及肝切除率，缩小肿瘤体积，改善患者生存质量，使得无法切除的肝转移病灶转化为可切除病灶。最

4、近两项研究显示，靶向治疗的加入使大约34%和58%的患者转化为可切除者。晚期患者的肝转移灶在转化为可切除后，其中位生存期可延长23倍，大大提高疾病治疗的有效率。根据最新的结直肠癌临床实践指南（2011版），晚期或转移性结直肠癌治疗中使用以靶向药物贝伐珠单抗、西妥昔单抗和帕尼单抗为主结合其它化疗药物的多种化疗方案。这些靶向药物的治疗机理主要是抑制血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子（EGF）受体的活性等。贝伐珠单抗是人源化单克隆抗体，可以阻断VEGF的生物活性，遏制原发肿瘤侵袭进入脉管系统以及转移灶的增殖，达到治疗结直肠癌的目的。西妥昔单抗和帕尼单抗是作用于EGFR的单克隆抗体，可以抑制E

5、GFR下游RAS/RAF/MAPK以及PI3K/AKT信号通路的活化，抑制肿瘤生长、侵袭和转移。帕尼单抗是人源化抗体，而西妥昔单抗则是人鼠嵌合抗体。EGFR下游信号分子如RAS，RAF或者PI3K等基因突变可以持续性激活信号通路，使得针对上游EGFR靶向药物的治疗失效。因此，确定这些分子基因突变与靶向药物疗效之间的关系，寻找其它相关分子的突变已经成为研究的热点，以期找到有效的预测靶点。然而，在以靶向治疗为基础的结直肠癌个体化治疗中，其靶标的检测和临床用药指导还存在很多分歧意见，主要包括靶标的检测内容（基因）和检测位点、检测方法，以及临床样本的收集和病人用药的建议等方面。因此，全面分析以上这些分

6、歧，规范结直肠癌的靶向治疗是临床实践亟待解决的问题。1、结直肠癌靶向治疗分子标志物（1）检测基因：目前治疗结直肠癌靶向药物包括：西妥昔单抗、帕尼单抗和贝伐单抗。西妥昔单抗和帕尼单抗在细胞的靶标为EGFR，因此检测EGFR信号通路下游 RAS/RAF/MAPK以及PI3K/AKT 分子的突变成为预测药物敏感性的指标。KRAS（第二外显子中12及13密码子）和BRAF（V600E）突变是美国国立综合癌症网络推荐的检测靶标，也是大多数临床研究和实践中都检测的内容；NRAS，PIK3CA，EGFR突变，PTEN 丢失以及EGFR过表达也是很多临床机构检测的内容之一。贝伐单抗的靶标是VEGFR，研究者主

7、要检测该基因的转录和蛋白的表达。根据目前临床研究的结果，KRAS和BRAF基因突变与药物疗效之间的关系已经确定，是推荐检测的内容。在西妥昔单抗和帕尼单抗的FDA标签中特别声明不推荐这类药物用于治疗存在上述突变的结直肠癌患者；而NRAS，PIK3CA与药物疗效之间的关系只是限于研究阶段，还存在争议。另外EGFR突变、基因过表达和PTEN丢失与药物的疗效关系见限于个别的研究，大多数研究发现这些指标与药物疗效之间没有显著相关性，已被大多数研究者否定。关于分子标志物在结直肠癌中突变频率，检测位点以及每个分子标记物与药物之间的关系如下:KRAS突变大约有40%的结直肠癌存在KRAS基因编码区的第二外显子

8、中12及13密码子的突变（179, 270），导致不依赖于EGFR激活状态的MAPK信号通路的持续性活性（constitutive active）, 回顾性研究结果显示：KRAS第二外显子中12及13密码子的突变直接决定了转移性结直肠癌患者对于EGFR靶向治疗的疗效，这些突变预示了对于西妥昔单抗及帕尼单抗治疗无效（179,210,234,257-262）。大型研究CRYSTAL最新数据表明，对于KRAS野生型患者，在标准一线化疗基础上加用西妥昔单抗不仅能够显著提高缓解率达17.6个百分点，使疾病缓解的几率提高了一倍，而且患者的总生存期也从20.0个月明显延长到23.5个月。由于KRAS基因检测

9、对于对结直肠癌的个体化治疗具有非凡的重要意义，因此它在2008年被写入新版美国国立综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南；NCCN也在2009年推荐所有转移性结直肠癌患者都应该接受KRAS诊断。在西妥昔单抗和帕尼单抗的FDA标签中特别声明不推荐这类药物用于治疗存在上述突变的结直肠癌患者（255,256）。因此KRAS基因成为首个决定转移性结直肠癌临床治疗决策的生物标记物。然而，在最近de Roock的研究中发现KRAS基因13密码子突变也许不能绝对预测上述的治疗无效。当然，这些发现目前还仅仅停留在假说阶段，任然需要前瞻性研究来判断KRAS基因13密码子突变者是否真的仍然可以从抗EGFR治

10、疗中获益。目前，具有KRAS基因13密码子突变的患者使用抗EGFR制剂治疗仍属研究范畴，专家组并不推荐用于常规临床实践。关于KRAS基因的预后价值，目前的研究结果不一致，因此并不推荐检测KRAS来预测结局（271）。因此专家组强烈推荐所有结直肠癌患者在被诊断为IV期转移时都应行肿瘤组织的基因分析。推荐在这个时点进行KRAS检测并不是要指导一线治疗的方案选择，早期确定KRAS状态是为后续治疗方案的选择做计划。应该注意的是因为抗EGFR治疗在I/II/III期结肠癌的治疗中并无作用，因此不推荐在这些早期患者进行KRAS测定。BRAF突变尽管KRAS基因突变预示着对EGFR抑制剂治疗无效，然而有40

11、%-60% KRAS基因野生型患者也对EGFR抑制剂无效。因此很多研究探索了位于KRAS基因下游的很多因素，期望能找到更有效的分子标志物来预测西妥昔单抗和帕尼单抗的疗效。BRAF基因编码一种蛋白激酶，是KRAS直接下游效应物它将细胞表面的受体和RAS 蛋白通过MEK 和ERK与核内的转录因子相连接，参与调节细胞的分化、分裂。大约有10%左右的结直肠癌存在BRAF基因（V600E）特定位点的突变（244, 276），这个位点突变占所有突变的90%以上。越来越多的研究显示BRAF突变与EGFR靶向药物的敏感性相关，最新的NCCN指南中有关BRAF在一线治疗病情进展后增加了下列内容： V600E B

12、RAF存在突变患者表现出预后更差的趋势。回顾性亚组分析显示，无论其V600E BRAF 是否存在突变，一线治疗使用EGFR单抗联合有效的化疗方案都有可能获益。目前有限的研究数据提示，一线治疗后病情进展的患者，如果存在V600E BRAF突变，那么使用EGFR单克隆抗体对肿瘤疗效欠佳。NRAS 突变NRAS是一个KRAS密切相关基因，其突变在结直肠癌中的发生率为3%-5%，回顾性研究结果显示，含有NRAS突变患者对西妥昔单抗的敏感性降低，因此NRAS基因突变可能成为预测EGFR靶向治疗的另一个指标分子。EGFR 突变和过表达研究表明，19%的结直肠肿瘤存在EGFR过表达。西妥昔单抗和帕尼单抗是直

13、接针对EGFR的单克隆抗体，可抑制其下游的信号通路，但是EGFR突变和过表达状态均不能预测这两种单克隆抗体在结直肠癌中的疗效。因此在新的临床实践指南中不推荐EGFR检测，不能以EGFR的检测结果来采用或排除西妥昔单抗或帕尼单抗的疗效。PI3K突变和PTEN丢失PI3K/PTEN是 EGFR下游信号通路中另外一个重要信号转导途径。在结直肠患者中，有15-20% 存在PIK3CA（编码PI3K催化活性亚基）基因突变，另外该信号通路的活化与肿瘤抑制磷酸酶PTEN丢失有关，而PTEN丢失在结直肠癌患者中有20%-40%的发生率。PIK3CA突变和PTEN丢失在临床预测中的作用还存在争议，临床期研究显示

14、，含有PIK3CA突变和PTEN丢失细胞对于西妥昔单抗的敏感性低。对于这两种标记物的预测作用，不同的临床研究得出了不一致的结果，因此，大样本量临床研究对于阐明这两种分子标记物在临床预测中的作用是很有必要的。（2）检测位点：KRAS基因的检测位点主要集中在第二外显子中12及13密码子，这两个位点也是目前临床上检测的靶位点。另外很多研究发现15，18，61，146密码子的突变也与西妥昔单抗和帕尼单抗的疗效相关，因此也在临床实践中作为检测的内容之一，但以上位点的临床学证据还不够充分，与药物疗效之间的关系还不十分清楚，本规范建议以KRAS基因第二外显子中12及13密码子作为临床用药的根据，而15，18

15、，61，146密码子的突变只作为临床研究的检测内容。 2 检测方法: 目前检测突变的方法包括：Sanger 测序法、焦磷酸测序法, 基于实时定量PCR检测方法如Allele-specific real-time PCR, PCR反应后染料溶解曲线方法（HRM）以及 PCR clamping等方法。市场上用于KRAS临床检测的试剂盒包括：the heraScreen K-RAS kit；the Invigene SP K-ras Codon 12/13 Set kit；the pyrosequencing-based PyroMarkTM K-RAS kit.基于PCR技术的Sanger 测序和

16、焦磷酸测序法被认为是检测突变的金标准方法。该方法可以检测基因序列中所有的突变位点和每个位点的突变类型，费用也相对低。但Sanger 测序法的灵敏度相对较低，仅能检测出野生型KRAS中10-30%的突变。焦磷酸测序的灵敏度相比Sanger测序高，可以检测野生型KRAS中5%-10%的突变基因，由于该方法所检测DNA模板片段较小（60-70bp），提高了小片段模板检出机会，适用于石蜡包埋等微量DNA组织样本的检测。基于实时定量PCR检测方法的最大优势是操作简单易行，时间短，灵敏度高（1%-10%）并且避免了外源污染，其缺点是费用高以及潜在的假阴性检出。大量研究报道，这几种检测方法在突变检出率上存在

17、一定的差别，Takashi Kobunai等发现，采用直接测序法只检测到32.1% (72/224)的KRAS突变，而采用基于实时定量PCR的方法PNA-clamp的KRAS检出率为43.3% (97/224)，说明采用不同的检测方法可能会导致10%左右的突变阳性患者漏检。综合以上因素，本规范建议采用焦磷酸测序法，在保证足够灵敏度的前提下，可以检测基因序列中所有的突变位点和每个位点的突变类型。 参考值要求：目前临床上还没有公认的KRAS检测灵敏度（突变型所占比例）要求，高灵敏度的KRAS检测方法在现在被认为是不必要的。对于低比例KRAS突变与靶向药物疗效之间的关系还没有相关临床证据，大样本量临

18、床研究的证据可能会对检测灵敏度提出新的要求。因此本规范不对检测方法的灵敏度做具体要求。3 样本类型：所有结直肠癌患者在被诊断为IV期转移时都应行肿瘤组织的基因分析。应该注意的是因为抗EGFR治疗在I/II/III期结直肠癌的治疗中并无作用，因此不推荐在这些早期患者进行KRAS测定。KRAS基因突变是结直肠癌发生中的早期事件，故其突变状态在原发肿瘤与转移肿瘤中表现为高度一致性。正因如此，KRAS基因型分析既可以选择原发瘤组织也可以选择转移灶组织进行。目前结直肠癌检测样本主要包括，冰冻组织，石蜡切片，穿刺样本，胆汁，血清，血浆。其中临床采用较多的是手术后新鲜组织和石蜡切片，临床机构这两种样本都未作

19、进一步要求，但考虑到肿瘤的异质性和取样的位置，这些样本中纯肿瘤细胞的含量会存在比较大的差异，对于一些检测灵敏度低的方法，比如Sanger 测序的方法，可能会造成结果出现假阴性，影响临床用药指导。因此对于样本中肿瘤细胞的含量，需经过病理学估计，确定最低肿瘤细胞含量，进一步检测其标记物的状态。对于穿刺样本，胆汁，血清，血浆等样本，许多临床机构也认为可以反应患者的基因状态，但由于这些样本中肿瘤细胞含量比较低，还没有大样本量的临床数据，因此，不建议根据这些样本的检测来指导临床用药。4 检测结果的报告：目前体外诊断机构对于标志物检测结果的报告也存在形式多样化，一些很重要的与用药指导信息没有包括在报告内容

20、中，本规范建议报告结果最少应包括以下内容：（1）患者个人信息；（2）样本来源，类型，鉴别以及样本中肿瘤细胞的含量；（3）检测方法，包括灵敏度和特异性等信息；（4）检测要求信息包括医学报告和病理报告；（4）结果的分子参数，解释和临床意义。5 生物标志物检测在结直肠癌治疗中的应用对于初始治疗采用FOLFOX或者CapeOX为基础的和化疗方案的患者，推荐使用FOLFIRI+西妥昔单抗/帕尼单抗（仅限于KRAS野生型）、伊立替康联合西妥昔单抗或伊立替康单药；对于初始治疗采用FOLFIRI为基础的和化疗方案的患者，推荐方案如下：FOLFOX或者CapeOX、西妥昔单抗+伊立替康。西妥昔单抗或帕尼单抗；对于初始治疗采用FOLFOXIRI方案的患者，推荐使用西妥昔单抗+伊立替康。或西妥昔单抗或帕尼单抗单药（仅KRAS基因野生型）。需要说明的是：分子标志物的检测结果必须与其它临床数据，病理学数据和实验室数据结合来确定时候可以使用靶向药物。1 西妥昔单抗和帕尼单抗在非一线治疗中的作用对于既往治疗进展但未用