液相色谱柱基础

1、液相色谱柱基础液相色谱柱基础熊莺2014年8月26日Agenda为什么要了解色谱柱12如何成为色谱柱专家在LC实验室中寻找销售机会3Agenda为什么要了解色谱柱12如何成为色谱柱专家在HPLC实验室中寻找销售机会3色谱法原理开始开始收集信息，收集信息， 设定要求设定要求选择初始的色谱选择初始的色谱柱柱, 流动相流动相调节调节 2k10 至至15a a OK ?是是否否优化优化N改变溶剂改变溶剂，色谱柱，色谱柱 分离分离是否符合要求是否符合要求 ?验证验证否否 是是HPLC方法流程Agenda2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 20136为

2、什么要了解色谱柱2如何成为色谱柱专家在HPLC实验室中寻找销售机会3高效液相色谱柱简介 色谱柱是一根填满填料的管子 柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢)和尺寸(内径,长短)不尽相同 色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 20137色谱柱的填充及结构2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 20138硅胶颗粒的形状不规则形状 (Irregular)大硅胶颗粒研磨，筛分颗粒尺寸和表面积限制球形（Spherical）目前流行的分析填料更好的性能，重现性球形硅胶基质

3、的分类 纯硅胶基质 杂化硅胶基质 其他色谱柱专家能力之一能够说出色谱柱的价值C18 填料的合成 1.硅胶基质的合成（多孔）Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)硅胶颗粒基质硅胶颗粒基质硅羟基硅羟基色谱柱填料电镜照片2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 201314键合相键合相(配体配体)：C18硅胶基质硅胶基质C18 填料的合成2. 配体键合 + HCl+SiCCCCCCCCH3CH3H3CClOHSiOOOSiCCCCCCCCH3CH3H3COSiOOO键合化学方程式残留硅羟基残留硅羟基端

4、基封口基团端基封口基团C18 填料的合成2. 端基封口四乙氧基硅烷四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷基硅烷 (MPEOS)甲基三乙氧基硅烷甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)第一代杂化颗粒的合成过程 硅胶快速溶解 严重的柱失效 柱寿命短暂Surface modified Silica Particles 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速度明显减缓 柱寿命大大延长XTerra Hybrid Particles普通硅胶柱普通硅胶柱基于杂化颗粒的基于杂化颗粒的Xterra 柱柱XBridge:第二代杂化填料的合成硅胶基体中插入的桥式乙基硅胶基体中插入的桥式乙基美国专利号

5、美国专利号 6,686,035 B2Tetraethoxysilane(TEOS)Bis(triethoxysilyl)ethane(BTEE)+4Polyethoxysilane(BPEOS)SiEtOEtOOEtEtOSiEtOEtOCH2EtOCH2SiOEtOEtOEtSiEtOOCH2CH2SiOSiEtOOEtSiOOOEtOSiOSiOEtOOOEtEtEtn挑战性流动相挑战性流动相: 0.02N NaOH pH 12.3 , 50C测试时的流动相测试时的流动相: 50/50 (v/v) 乙腈乙腈/水水 , 50C标准测试物标准测试物: 苯癸酮苯癸酮01020304050XBri

6、dge C8XBridge C18XBridge PhenylXBridge Shield RP18XTerra MS C18Symmetry C18要使柱效降低一半要使柱效降低一半, 需将色谱柱曝露在需将色谱柱曝露在0.02N NaOH (pH 12.3)和和 50下的小时数下的小时数将高pH 柱稳定性推向新极限 + HCl+SiCCCCCCCCH3CH3H3CClOHSiOOOSiCCCCCCCCH3CH3H3COSiOOO优点：键合密度高，样品载量大优点：键合密度高，样品载量大缺点：疏水性最强，对极性物质保留不佳；容易发生酸水解键和相流失缺点：疏水性最强，对极性物质保留不佳；容易发生酸水

7、解键和相流失键合方式：单点键合优点：酸性条件下键和相稳定性高（耐水解）键合方式：三点键合带有内嵌极性配体的色谱填料 OSiCH3CH3PolarGroup内嵌极性基团配体OSiCH3CH3传统直链烷基配体Shield RP18Shield RP18作用机理水 “屏蔽”层CH3NH3CH+通过极性嵌入基团保留水浸润： 可完全兼容可完全兼容100%水相水相 屏蔽硅醇基，对碱性化合物峰形更佳屏蔽硅醇基，对碱性化合物峰形更佳 提供与提供与C18不同的选择性不同的选择性Chromolith整体柱Macropores: 2m mm Mesopores: 130 双孔结构双孔结构表面带电杂化颗粒技术Step

8、 1Step 2Step 3未经键合的BEH颗粒始于稳定耐用的、超高效的亚乙基桥杂化(BEH)颗粒技术在高度控制下施予表面电荷为颗粒表面添加可重现的低浓度水平的电荷相键合与封端用合适的键和相化学赋予官能团化核壳技术 核壳技术：将多孔硅壳熔融到实心的硅核上面而制备出的。这些多孔的“光环”状颗粒具有极小的粒径分布和扩散路径，可以同时减小轴向和纵向扩散，因此减小峰宽，提高柱效。2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 201328ionKey/ MS系统的iKey微流分离装置只有于智能手机一样的大小，但包含了流路连接、电子设备、ESI接口、色谱柱加热器

9、、eCord智能芯片，以及1.7m颗粒填充的内径150 m通道。该设备能够连续进行数百个UPLC分离，同时确保重复性，并且分析性能不会降低。ionKey/ MS系统比较常见的几个品牌 Waters ：Xbridge(BEH)，Sunfire， Symmetry,AtlantisT3 Merck: Chromolith 整体化柱,Purosphere STAR,Lichrospher RP18e Phenomenex Gemini,Luna 资生堂 Capcell Agilent ZorbaxExtend，Zorbax XDB Kromasil, Hypersil ODS22013 Lab Wa

10、ter China Marketing Plan| 20 Feb. 201329色谱柱专家能力之二了解色谱柱的性能2013 Lab Water China Marketing Plan| 20 Feb. 201330对色谱柱填料的了解(一)键合相化学 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN填料的品牌-不同硅胶颗粒基质 密度，表面积，孔径纯度(残留硅羟基活性不同)键合相的种类:C18,C8, Shield RP18不同 C18配体键合水平 单键键合,双键键合,三键键合 配体覆盖率(疏水性不同)选择性差异来源对色谱柱填料的了解(二)对色谱柱填料的了

11、解(三)含碳量 含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗对色谱柱填料的了解(四)平均颗粒度，颗粒度分布 颗粒度 颗粒度越小：柱效越高 柱压越高 颗粒分布 颗粒分布越宽:柱效低 颗粒形状 球型 无定型对色谱柱填料的了解(五)硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志对色谱柱填料的了解(六)填料的pH稳定性 硅胶填料 pH：2-8 聚合物填料

12、 pH：2-12 杂化硅胶填料 pH：2-12pH值小于2时键合相水解pH值大于8时硅胶溶解1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH硅胶的溶解曲线硅胶表面键合相的水解（PH2）Low pH (hydrolysis of ligand)Note: Sometimes called “Column Bleed” + HCl+SiCCCCCCCCH3CH3H3CClOHSiOOOSiCCCCCCCCH3CH3H3COSiOOOSiCCCCCCCCH3CH3H3CHOOHSiOOO对色谱柱填料的了解(七)填料的热稳定性 普通硅胶填料 柱温:60 聚合物填料(高温GPC) 柱温:150 杂化硅胶填料(X

13、Terra,XBridge) 柱温:90色谱柱专家能力之三简单的色谱柱维护保养理念测柱效-良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试条件定期检测柱效定期检测仪器的谱带展宽计算色谱柱的柱效 N 理论塔板数计算公式：理论塔板数计算公式：Ws 方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W3s9 3sW4s16 4sW5s25 5s21WVN正确使用色谱柱(一)样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如溶样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否有相互作用正确使用色谱柱（二）流动相方面

14、 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 有机溶剂：色谱纯,杂质含量尽量低,并与填料相匹配 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例色谱柱的在线保护装置给色谱柱提供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染装置 在线过滤器 Sentry Guard 保护柱色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次

15、冲洗记记住住每每种种色色谱谱柱柱可可能能有有特特定定的的方方法法 一一定定要要先先看看其其使使用用说说明明！色谱柱的清洗一些供参考的反相色谱柱清洗程序:极性样品极性样品非极性样品非极性样品蛋白样品蛋白样品1.水水1.异丙醇或合适比例的水异丙醇或合适比例的水溶液溶液1.重复进样少量重复进样少量DMSO(二甲二甲基亚砜基亚砜)2.甲醇甲醇2.四氢呋喃四氢呋喃2.梯度洗脱梯度洗脱,从从10%到到90%的的B液液3.四氢呋喃四氢呋喃3.二氯甲烷二氯甲烷A=0.1%TFA水溶液水溶液B=0.1%TFA乙腈溶液乙腈溶液4.甲醇甲醇4.正己烷正己烷3.梯度清洗梯度清洗,从从10%到到90%的的B液液.A=水水,B=乙腈乙腈5.水水5.异丙醇异丙醇,接着用合适比例接着用合适比例的异丙醇的异丙醇/水混合溶液水混合溶液4.流动相流动相6.流动相流动相6.流动相流动相色谱柱的存放存放前的处理 除去杂质、缓冲盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干涸避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度Agenda2013 Lab Water China Market