干旱胁迫对植物生理生化指标的影响

1、2014-2015学年上学期植物生理学实验科技论文题目 干旱胁迫对小麦生理生活指标的影响 姓名 张蓉娜 学号 124120249 院、系 生命科学学院应用生物教育 专业 12 应用生物教育A班 任课教师 李忠光（教授） 二0一四年十二月干旱胁迫对小麦生理生化指标的影响12应用生物教育A班 张蓉娜 124120249摘要：干旱胁迫是影响小麦产量的重要胁迫因素，而干旱胁迫对小麦生理生化指标有显著影响。通过对干旱胁迫下的小麦幼苗与正常小麦幼苗中的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、还原型谷胱甘肽(GSH)的提取与含量测定分析，实验结果

2、表明：干旱胁迫下的小麦幼苗的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、还原型谷胱甘肽(GSH)的含量均比正常小麦幼苗的含量高，证明干旱胁迫对小麦生理生化指标有影响。 关键词：干旱胁迫、小麦、生理指标 引言：目前全球干旱、半干旱地区约占土地总面积的36,占耕地面积的43，大多数国家都面临水资源危机，我国也不例外1。干旱在我国分布广泛，一年四季均有可能发生，对农业生产影响十分严重。小麦是世界上仅次于玉米的第二大粮食作物，世界上约有70的小麦播种面积分布在干旱、半干旱农业区2。如果干旱发生在小麦开花期或者灌浆期，就会导致其灌浆期减短、产量严

3、重减少3。其在生长过程中，经常会受到干旱的影响，在世界范围内，由于水分所造成的减产，可能要超过其他因素所导致的产量损失总和4。由于环境污染导致可利用水资源大大减少，干旱现象日益严重。因此，研究干旱胁迫对小麦的生理生化指标的影响，提高小麦的抗旱性能、提高小麦产量具有重要意义。1材料与方法：1.1实验材料：小麦种子和玉米种子1.1.1材料处理：小麦和玉米种子吸胀12h后即可用于测定种子发芽率的实验。选取长势一致的小麦幼苗做干旱5天处理。干旱胁迫下处理的小麦幼苗为实验组，正常培养的小麦幼苗为对照组。1.1.2实验试剂：TTC、曙红染液、0.1% HgCl、蒸馏水、3% 磺基水杨酸（SSA)、石英砂、

4、冰乙酸、茚三酮、0.1% TCA、0.5% TBA、20% 三氯乙酸（TCA）、0.3% TCA 用20% TC配制、0.1 %Ti(SO4)2用20%（v/v)H2SO4配制、50 mmol/L PBS(PH=6.0，内含0.1 mmol/L EDTA，1%PVP)、POD反应混合液（10 mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）、 PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）、3% 三氯乙酸（TCA）、1M NaOH 、2 mM DTNB、5%三氯乙酸（TCA）、0.15 M NaH2PO4 (pH=7.4)、44%磷酸和4%联吡啶、3%FeCl3

5、、1.1.3实验仪器：研钵、试管、电子天平、移液管、洗耳球、722型分光光度计、离心机、微量加样器、恒温水浴锅。1.2实验方法：1.2.1种子发芽率的测定：各取50粒吸胀的玉米种子或小麦种子，沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色（30水浴 20min）；另50个半粒进行曙红染色（室温染色10 min），洗净后观察。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。1.2.2脯氨酸（Pro）含量的测定：提取：分别取0.1 g实验组和对照组的幼苗加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂充分研磨用2 mL 3% SSA洗研钵 5000rpm离心10 m

6、in 量上清液体积。测定：上清液各2 mL 分别加入 2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂煮沸15 min冷却后5000 rpm离心10 min（若没沉淀可略此步骤） 分别测定A520。计算：Pro content = (umol.g-1FW)1.2.3丙二醛（MDA）含量的测定：提取：分别取0.1 g实验组和对照组加入3 mL 0.1% TCA 和少许石英砂充分研磨用2 mL 0.1%TCA洗研钵5000 rpm离心10 min 量上清液体积。测定：分别取上清液各1 mL 加入0.5%TBA（用20%TCA配制） 3 mL煮沸15 min冷却后5000 rpm离心5 min （视沉淀有无）分别

7、测定OD450和OD532。计算： OD450=C1×85.4OD532= C1×7.4+155000×C2求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71 OD450C2/（mol/L）=6.45 OD532- 0.56OD450式中，C1为可溶性糖的浓度，C2为MDA的浓度。1.2.4过氧化氢（H2O2）含量测定：提取：分别取0.1 g实验组和对照组加入3 mL 0.3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用2 mL TCA洗研钵5000 rpm离心10 min 量上清液体积。测定：分别取上清液各4 mL 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2

8、SO4配制0. 2 mL摇匀 OD410。计算：H2O2 content = (umol.g-1FW)1.2.5抗氧化酶活性的测定：提取：分别取0.1 g实验材料加入少许石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,内含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨转入离心管中用2 ml提取液洗研钵 5000 rpm离心10 min 量上清液体积用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80保存。 POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）2.95 ml，加入酶液50 ml（空白调零用提取液取代），立即记

9、时，摇匀，读出反应2 min时的A470。PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.9 ml，加入酶液0.1 ml（空白调零用提取液取代），立即记时，摇匀，读出反应 2 min时的A410。计算： 以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：POD activities = (umol.g-1FWmin-1)PPO activities = (U.g-1FW)1.2.6谷胱甘肽(GSH)的含量测定：提取：分别取0.1 g实验组和对照组的幼苗加入3 mL 3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用2 mL 3% TCA洗研钵 5000

10、 rpm离心10 min 量上清液体积。测定：上清液各2 mL (空白用3%三氯乙酸代替) 分别加入0.4 mL1M NaOH 1 mL 2 mM DTNB 25 5 min测定A412计算：GSH content = (umol.g-1FW)2结果分析：表一 曙红染色、 TTC法测定小麦种子发芽率 曙红染色 TTC染色成活粒数（个） 47 46总数（个） 50 50成活率 94 % 92 %表二 曙红染色、 TTC法测定玉米种子发芽率 曙红染色 TTC染色成活粒数（个） 48 45总数（个） 50 50成活率 96 % 90 %表三 干旱胁迫和正常条件下小麦的各项生理指标条件 Pro含量 M

11、DA含量 H2O2含量 POD含量 PPO含量 GSH含量 (mmol.g-1FW) (mmol/L) (mmol.g-1FW) (mmol.g-1FWmin-1) (U.g-1FW) (mmol.g-1FW)干旱 0.10 0.59 0.48 84.67 1754 15.34正常 0.01 0.21 0.09 35.73 1304 5.722.1种子发芽率的测定：由表一、表二可知玉米和小麦的发芽率都达到了90%以上，发芽率比较高。2.2脯氨酸（Pro）含量的测定：图一 Pro含量由表三和图一中可得出，在干旱胁迫下小麦的脯氨酸含量显著增加。2.3丙二醛（MDA）含量的测定：图二 MDA含量由表

12、三和图二中可得出，在干旱胁迫下小麦的丙二醛（MDA）含量有所增加。2.4过氧化氢（H2O2）含量测定：图三 H2O2含量由表三和图三中可得出，在干旱胁迫下，小麦细胞中H2O2的含量显著增加，2.5抗氧化酶活性的测定：2.5.1 POD的测定：图四 POD含量由表三和图四中可得出，在干旱胁迫下，小麦细胞中POD的含量明显增加。2.5.2 PPO的测定：图五 PPO含量由表三和图五中可得出，在干旱胁迫下，小麦细胞中PPO的含量有所增加。 2.6谷胱甘肽(GSH)的含量测定：图六GSH含量由表三和图六中可得出，在干旱胁迫下，小麦细胞中GSH的含量有所增加。3讨论：脯氨酸是植物细胞内重要的渗透调节物质

13、，在逆境条件下，脯氨酸会主动积累，引起细胞渗透势下降，从而提高细胞的吸水能力或阻止水分外渗，有助于细胞和组织的持水，避免细胞过度失水5 。实验结果显示，在干旱胁迫下小麦细胞通过增加脯氨酸的含量，使细胞的渗透势降低，阻止水分丧失，使自身新陈代谢能够正常进行。是小麦抗干旱胁迫的一种机制。在逆境胁迫条件下，植物往往发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化产物之一，其含量的高低可反应逆境胁迫下植物伤害程度的大小，是膜脂过氧化程度的重要标志6 。实验结果显示，干旱胁迫下的小麦MDA含量升高，证明干旱胁迫下小麦细胞的膜脂过氧化程度还是较高的。植物在干旱时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2

14、可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体7。实验中干旱胁迫下的小麦H2O2含量升高，证明干旱胁迫对小麦细胞的还是有所伤害的。在POD生理功能中,多数是与某种或多种胁迫作用导致细胞膜的损伤和破坏、细胞的空间结构被打破以及损伤信号的转导等一系列生理生化变化有关8。已知在干旱胁迫下，小麦细胞中H2O2的含量显著增加，而H2O2的增加对小麦细胞是有害的。POD 是植物体内担负清除H2O2的主要酶类之一,POD 能催化H2O2氧化其他底物后产生H2O9。在干旱胁迫下，POD的含量的增加也是小麦抗逆境的一种机制。多酚氧化酶(PPO)是植物组织内广泛存

15、在的一种含铜氧化酶10。在植物的呼吸作用中,呼吸链的末端氧化酶是直接把呼吸底物的中间产物氧化时脱出的电子传递给O2的氧化酶,PPO是其中之一11。PPO和POD同属抗氧化酶，二者在逆境中共同起到抗氧化的功能。谷胱甘肽（GSH）是植物体内一种重要的抗氧化剂，可以清除细胞代谢过程中产生的多余活性氧自由基，减少由于膜脂过氧化作用而对细胞造成的伤害， 在植物抵抗逆境胁迫中起着非常重要的作用12。生物体内不同的胁迫响应途径中，利用 GSH 的亲核活性来消除活性氧和重金属等对细胞的伤害。因此，在生物的氧代谢及抗逆生理中GSH发挥着重要的作用13。干旱作为一种生物逆境胁迫，一定会对小麦造成影响。干旱会改变小

16、麦生理生化指标，从而影响植物的生长。经过本次实验可得知，在干旱胁迫下，小麦的脯氨酸、丙二醛、H2O2、抗氧化酶、谷胱甘肽的含量均比正常条件下高。当小麦受到干旱胁迫时，小麦为了对抗干旱作用，产生了一套应对干旱胁迫的抗逆机制。以降低干旱胁迫对植物正常生命活动的影响。4参考文献：1葛培, 郭广芳, 晏月明. 小麦抗旱机理研究进展J. 生物技术通报, 2010, (4): 22-27.2张林刚，邓西平小麦抗旱性生理生化研究进展J干旱地区农业研究, 2000,18(3): 87-91. 3 Jingjuan Z, et al. Water deficits in wheat：fmcmn exohydro

17、lase (1·FEH) mRNA expression and relationship to soluble carbohydrate concentrations in two varietiesNew Phytologist，2009, 181: 843-850.4王可玢, 许春辉，赵福洪，等水分胁迫对小麦旗叶某些体内叶绿素A荧光参数的影响明J生物物理学报, 1997,13(2): 273-278.5高建社, 王军, 周永学, 等. 5个杨树无性系抗旱性研究J. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2005, 33(2): 112-116. 6王爱国, 邵从本, 罗广华.

18、丙二醛作为脂质过氧化指标的探讨J. 植物生理通讯, 1986, (2): 55-57. 7吴强, 冯汉青, 李红玉, 等. 干旱胁迫对小麦幼苗抗氰呼吸和活性氧代谢的影响J. 植物生理与分子生物学学报, 2006, 32 (22) 17-224. 8 覃鹏, 刘叶菊, 刘飞虎. 干旱处理对烟草叶片SOD和POD活性的影响A. 中国烟草科学, 2005, (2): 28-30.9 梁新华, 史大刚. 干旱胁迫对光果甘草幼苗根系MDA含量及保护酶POD、CAT 活性的影响A. 干旱地区农业研究, 2006, 24（3）: 108-110. 10 李广酶，唐顺连，商振清，等.渗透胁迫对玉米幼苗保护酶系统的影响J.河北农业大学学报，1994，17（2）: 1- 5.11 段云青, 王 艳, 雷焕贵. 镉胁迫对小白菜POD、PPO和SOD活性的