ELISA一些体会

1、酶联免疫吸附试验的一些体会检验科 常会忠 免疫吸附剂 ELISA 的步骤和注意事项 ELISA的相关知识免疫吸附剂免疫吸附剂 固相载体固相载体-聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。性。 聚氯乙烯聚氯乙烯-聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。烯高，但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好，空白值低，孔吸附性能好，空白值低，孔底透明度高底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板

2、各，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。孔之间性能相近。 将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被被(coating(coating) )。 包被方式包被方式包被用抗原 蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的。与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的。 脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入（例如乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，开盖置板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相

3、表面。然干固在固相表面。包被用抗体 IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在FcFc段上，抗体段上，抗体结合点暴露于外。结合点暴露于外。包被的条件包被的条件 pH9.6 pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液 pH7-8pH7-8的的TrisTris-HCL-HCL缓冲液。缓冲液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜，3737中保温中保温2 2小时。小时。封闭封闭 封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关是继包被之后用高浓度的无关蛋白质

4、溶液再包被的过程。封闭就是让大量不蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血的小牛血清或清或1%1%明胶。明胶。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封闭。固相均需封闭。加样 温育 洗板 ELISA加样量小（5-100l），其准确性直接影响实验结果，一般应在10%以内。 要先加稀释液后加样本 温箱实测温度是否准确，允许有1的误差； 洗板机 每

5、个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿 。显色 加入顺序 HRPHRP的底物的底物 DH2+ H2O2 DH2+ H2O2 D D+ 2H2O+ 2H2O 上式中，上式中， DH2DH2为供氢体，为供氢体， H2O2H2O2为受氢体为受氢体。 10-15分钟，根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间. 结果判读 定性试验 国内外为便于统一计算，一律按S/C.O方式报告 。 阴阳性对照测定值 的有效性。 精密度：ELISA试剂一般指其批内CV，其值应小于15%。结果判读 Cut Off的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有： A） C.O

6、=2.1N（当N不足0.05时按0.05计）， B） C.O=0.5N，从抑止率公式换算而来 C） C.O=N+C（C为常数），用于间接法。 D) C.O=CP+N（C为常数），用于间接法。此公式最客观，结果判读 灰区的设置有： 1）C.O（1CV）， CV为该试剂的批内CV (一般在15-20%间）； 2）C.O2s，s为实验室做室内质控的SD。 3）0.7C.O样本OD1.4C.O参考标准品参考标准品 英国国立生物学标准及控制品研究院（NIBSC）：免疫血清学 IU/ML 德国鲍尔-艾立希研究院（PEI）：病毒学、免疫血清学等，传染病标志物最全PEI/ML。 法国国家中心实验室（LNS）、法国输血协会（SFTS）：病毒性肝炎、艾滋等血清盘。NG/ML参考标准品参考标准品 荷兰输血中