生物化学实验

1、过氧化物酶的提取、分离、纯化及其测定实验1 过氧化物酶的提取、分离、纯化 一、目的意义酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶，首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化。不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。本实验的目的是了解并掌握匀浆、盐析、透析及酶活性测定的原理及操作。二、原理（

2、一）酶的提取 从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，也有在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。其次，细胞中存在抑制物质，如酚、

3、酸、离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如-SH、-NH2，通过1,4-加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。在提取过程中为了尽量减少酚类的影响，一般提取液常选用高pH值的缓冲溶

4、液，因为在高pH值时，酚类大部游离而不与蛋白质形成强的氢键，但高pH值促进酚类氧化，同时降低酚类吸附剂（如PVP）的有效性，通常采用pH 6.7-7.2。已经知道PVP能与游离酚羟基形成强的氢键复合物，是酚类化合物的有效结合剂。在提取线粒体时加入可溶性PVP，提取可溶性酶时加入不溶性交联PVP（Polyvinyl Polypyrrolidone，简称PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金属元素及PVP单体，可加10 HCl煮沸10分钟，用NaOH中和，再用水洗几次，直至中性，纯化后的PVPP不必干燥就可直接应用。植物细胞有坚韧的细胞壁，需要强烈的

5、方法去破碎，少量样品可用研钵加石英砂研磨，或用玻璃匀浆器。大量样品则需用电动匀浆器。为减低研磨或匀浆过程中发热，所用器皿和溶液需要预冷，提取液的用量一般为组织的1-5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般宁可用量小些，将残渣再提取一次。提取匀浆时加入酚类结合剂PVPP、金属螯合剂Na2-EDTA，以及-SH化合物以保护蛋白质，或加入非离子型去垢剂如Triton X-100，以增加蛋白质的可溶度，常用于与膜脂结合的酶。总之，可以通过试验确定提取蛋白质的最佳条件。（二）分离和纯化 酶的分离和纯化包括两方面的工作：一是将含酶的提取液从很大体积浓缩到比较小的体积；另一方面是将酶制剂中大量的杂蛋白

6、质和其他大分子物质分离除去。在分离提纯过程中始终需要测定酶的活性和蛋白质含量，以酶总活性的回收来判明提纯过程中酶的损失情况，以比活性的提高程度来确定提纯方法的有效性。一个好的提纯步骤应该是总活性的回收率高，比活性提高的倍数也较大，但实际上两者往往难以兼顾。因而可在比活性多提高一些和总活性多回收一些之间，作出适当的选择。 上面制备得到的提取液中，除含有所需要的酶外，还含有其他蛋白质，以及其他大分子和小分子化合物杂质。要在许多蛋白质的混合物中分离出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有盐析法、柱层析法、薄膜超滤法、亲和层析法、电泳法等。在大体积的提取液中一般先采用硫酸铵分级盐析沉淀。盐析法是提纯酶使用最

7、早的方法之一，迄今仍广泛使用，而且在高浓度的盐溶液中酶蛋白不易变性而失去活性，利于工作在室温中进行。不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低，盐析法就是利用这一性质，将不同性质的蛋白质分离，选择合适饱和度的硫酸铵，使沉淀的蛋白质的酶活性最大。大多数酶的活性存在于35-45 和45-55饱和度硫酸铵沉淀的部分，但也有存在于65-80饱和度的（如花椰菜根的过氧化物酶）。沉淀的蛋白质经离心后收集之；再溶于少量缓冲溶液中，经透析或凝胶柱过滤，以除去硫酸铵及其他小分子杂质，然后再经过柱层析分离。由于吸附剂的不同，又有吸附柱层析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等。对于不同的支持物采用的洗脱方法也

8、不同，分子筛类型凝胶过滤柱层析，洗脱液只要用一定浓度的缓冲液就可以了，亦即等浓度洗脱。对于吸附柱和离子交换柱层析，往往要采用浓度梯度溶液进行洗脱，最方便的是线性梯度浓度，当然用非线性梯度会得到更好的分离效果。柱层析一般都需要自动收集仪，如果能配用蛋白质检测仪就更好了。目前柱层析和硫酸铵分级沉淀一样，已经成为一种常规的酶的分离提纯的步骤之一了。近年来纯化酶常用的一种有效方法为亲和层析。主要利用酶和底物、抑制剂或辅酶具有一定的结合能力，这一性质即可用来分离、提纯酶。首先选择一支持物，如琼脂糖（Sepharose）将底物、竞争性抑制剂或辅酶，以共价键的形式连接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流过装有

9、专一性底物、竞争抑制剂或辅酶的层析柱，酶即被保留在支持物上，再经过充分洗涤除去未被吸附的杂质，然后用含有一定浓度的底物或竞争性抑制剂或辅酶的缓冲液，进行竞争性洗脱。如果亲和剂选择合适，往往能得到较高纯度的酶，是酶分离、纯化中既方便又最有效的一种方法。（三）酶活力的测定酶的活力表现为催化某一反应的速度，反应速度越大，酶的活力也越大。酶催化的反应速度可以用单位时间内底物的消耗量或产物的积累量来表示。由于酶的催化作用和周围环境的关系十分密切，环境的温度、pH、离子强度等都对酶的活力有很大的影响，因此测定酶活力时应该使这些条件保持恒定。酶活力大小常以每mg酶蛋白每min所分解的底物量（或生成的产物量）

10、mol数表示之。 测定酶活性的方法很多，常因反应的底物和产物的性质不同可选用不同的方法，应用最广泛的是比色法或分光光度法。凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定。如果酶催化的是一需氧反应，如氧化酶，则可用测压法或氧电极法。如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脱氢酶和氧化还原酶。或者反应产生H2O2，如一些氧化酶，这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行测定。总之，测定酶活性的方法很多，应根据具体情况选择合适的方法。 三、实验材料、仪器、试剂1. 实验材料：新鲜杨树叶片。2. 仪器：高速冷冻离心机、分光光度计、组织

11、捣碎机、电磁搅拌器、天平、微量进样器、透析袋、量筒、烧杯、移液管、试管等。3. 试剂：硫酸铵、0.02 mol·L-1 KH2PO4溶液、BaCl2溶液、0.01 mol·L-1 pH 7.0磷酸缓冲液、0.01 mol·L-1 pH 6.0磷酸缓冲液、0.04 mol·L-1 H2O2溶液、0.02 mol·L-1愈创木酚溶液、20三氯乙酸溶液、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250等。四、操作步骤（一）酶的提取用天平称取剪碎的杨树叶片40g，先加入120mL 0.02 mol·L-1 KH2PO4溶液，在组织捣碎机中搅成匀浆，再用80

12、mL KH2PO4溶液分次洗净。匀浆全部倒在大烧杯中，用4层纱布过滤，量取滤液体积。滤液8000rpm冷冻离心15min，弃去沉淀，量取上清液体积，将上清液放入冰箱冷藏2h。上清液即为酶的粗提取液。 （二）硫酸铵分级沉淀吸取6ml酶液留作酶活性及蛋白质含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固体硫酸铵，使达35饱和度（参阅附录）。加硫酸铵时要缓慢，以避免造成局部浓度过高，在电磁搅拌器上边搅拌边加入。然后置冰箱中静置20min，离心15min。分别收集上清液和沉淀，量取上清液体积，再加入硫酸铵使达65饱和度，冰箱中静置20min，离心15min，收集沉淀和上清液。按这样的方法分别收集35、65、80

13、饱和度的硫酸铵沉淀。每部分沉淀分别复溶于1/20原始体积的0.01 mol·L-1 pH 6.0磷酸缓冲液，装入透析袋，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中进行透析过夜，其间更换KH2PO4溶液约4次，直至无SO42-析出为止（用BaCl2溶液检查）。待透析完毕后，分别量取体积，保存于冰箱中备用。（三）蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝G-250法）1.标准曲线制作（参阅实验指导）： 2.样品提取：按下表比例稀释原提取液及各分部沉淀。样品原提取液35%盐析65%盐析80%盐析稀释倍数1005010103.样品测定（参阅实验指导）（四）酶活性的测定（愈创木酚比色法）: 参阅实验指导

14、。五、结果计算将结果填入下表中。项目粗酶液硫酸铵饱和度（%）0-3535-6565-80体积（mL）蛋白质g·mL-1总量（mg）%酶活性U·mL-1U%比活性附：2、考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量（一）原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者吸收峰在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质范围内（01000g·mL-1），蛋白质色素结合物在595nm波长下的消光值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

15、蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该反应非常灵敏（比斐林酚法还高4倍），可测微克级蛋白质含量，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的蛋白质定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：小麦叶片及其他植物材料。2. 仪器：分光光度计、离心机、药物天平、容量瓶、移液管、试管等。3. 试剂（1）100g·mL-1标准牛血清白蛋白溶液：精确称取牛血清白蛋白10mg，溶于100mL蒸馏水中。（2）考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝

16、G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入100mL 85磷酸（W/V），最后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中。此溶液在常温下可放置一个月。（3）其他试剂：90乙醇、85磷酸。（三）操作步骤1. 标准曲线制作：取6支试管，按下表添加试剂。摇匀，放置2min后在595nm波长下比色，记录消光值。以消光值为纵坐标，牛血清白蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管编号123456标准牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（g·mL-1）考马斯亮蓝G-250（mL）消光值01.0050.20.82050.40.64050.60.46050.80.28051.0010052. 样品提

17、取：称取鲜样0.51.0g放入研钵中，加2mL蒸馏水研成匀浆，转移至50mL容量瓶中，再以蒸馏水分次洗涤研钵，收集于同一容量瓶中，用水定容至刻度，放置30min以充分提取，其间摇动几次。然后过滤或离心，清液即为待测液。3. 样品测定：吸取提取液1mL，放入试管中，加5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分摇匀，放置2min后于595nm处比色，记录消光值。（四）结果计算式中：为蛋白质含量（mg·g-1）；为从标准曲线上查得蛋白质浓度（g·mL-1）；为提取液总体积（mL）；为样品重（g）。3、愈创木酚比色法测定过氧化物酶活性（一）原理在过氧化物酶催化下，过氧化氢将愈创木酚氧化成

18、茶褐色产物，其在470nm处有最大吸收峰。该生成物颜色的深浅与其浓度成线性关系，故可用分光光度计测量生成物的含量，间接测定过氧化物酶的活性。（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：各种植物材料均可。2. 仪器：分光光度计、离心机、磁力搅拌器、秒表、研钵、容量瓶、量筒、试管、移液管等。3. 试剂：（1）10mmol·L-1 pH 7.0磷酸缓冲液：准确称取0.156g NaH2PO42H2O，溶解后定容至100mL，即为A液；准确称取0.35g Na2HPO4·12H2O，溶解后定容至100mL，即为B液。取A液39mL和B液61mL混匀，即为10mmol·L-1

19、 pH 7.0磷酸缓冲液。（2）40mmol·L-1 H2O2：吸取0.318mL 30 H2O2（比重1.438g·mL-1），加水定容至100mL。（3）20mmol·L-1愈创木酚：吸取0.2mL愈创木酚，加水定容至100mL，贮于棕色瓶中。（4）20三氯乙酸：称取20g三氯乙酸，用蒸馏水溶解后定容至100mL。（三）操作步骤1. 酶液制备：称取植物材料0.31.0g，加入适量的pH 7.8磷酸缓冲液，充分研磨至无粗纤维为止，分装在两个塑料小离心管中，再用pH 7.8磷酸缓冲液洗净研钵，洗液一并转入小离心管，10000rpm离心20min，上清液即为酶提取液

20、。或称取植物材料1.0g，充分研磨至匀浆，加入pH 7.8磷酸缓冲液6mL，完全转移至离心管中，4000rpm离心10min，此步离心液可用于丙二醛含量测定，剩余部分15000rpm再离心10min，上清液冷冻保存，可用于POD、SOD活性测定。2. 酶活性测定：取两只试管，1支为测定管（可设重复），另1支为对照管，按下表加入试剂，配成POD反应体系（随酶量的增减，相应改变加入磷酸缓冲液的量，以保持总体积不变）。摇匀，放入34水浴中保温3min后，加入60L左右三氯乙酸，摇匀，以对照管作用液为空白，在470nm波长下比色，读取OD值。试 剂磷酸缓冲液愈创木酚H2O2酶提取液蒸馏水OD值测定管2

21、.91mL0.05mL0.02mL0.02mL对照管2.91mL0.05mL0.02mL0.02mL（四）结果计算 过氧化物酶活性单位（U）定义为1g鲜样1min内470nm处吸光值升高1 个单位所需的酶量。式中：为470nm下的OD值；为样品重（g）；为反应时间（min）；为提取时酶液体积（mL）；为反应时酶液体积（mL）。【附注】1. 反应液中加入酶液的数量视酶活性而定，可根据显色情况增加或减少。2. 加入三氯乙酸是为了终止酶的活性，故要在保温后加入。具体加入数量应以OD470相对稳定为度，如随时间延长，比色液一直在加深（OD470增大），即说明加入的三氯乙酸量少，此时应适量增加。适用范围

22、一般为4080L。3. 随加入酶液及三氯乙酸量的增减应相应改变加入磷酸缓冲液的量，以维持总体积不变。4 植物同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳目的意义同工酶（isoenzyme或isozyme）是指生物体内存在的一类催化相同反应而其分子结构以及理化性质不同的酶，是不同基因表达的结果。这一术语是1959年由Markert首先提出的。同工酶的具体作用是为了以不同的方式和途径来满足细胞或组织中特殊代谢的需要。研究表明，它与生物的遗传、生长发育、代谢调节、抗逆生理以及生物的进化有着密切的联系。因此测定同工酶在理论和实践上都有重要的意义，广泛受到生理生化及遗传育种研究者的高度重视。同工酶的研究方法很多，但最常用的

23、是把凝胶电泳技术与酶染色技术结合起来，称为酶谱技术。这一技术方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）分离植物材料中的过氧化物酶（peroxidase，POD）、酯酶（esterase，EST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷丙转氨酶（GPT）、苹果酸脱氢酶（Malate Dehydrogenase，MDH）等同工酶，然后利用各自不同的反应机理进行鉴定。通过本实验，学习掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与操作方法，同时学习同工酶分析的方法酶谱技术。电泳技术一、原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）单

24、体和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。凝胶电泳具有浓缩效应（在样品胶和浓缩胶中进行）、分子筛效应和电荷效应（在分离胶中进行）。被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，因此在电泳时产生不同的泳动速度而相互分离。二、实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：小麦叶片或其他植物组织。2. 仪器：电泳仪、电泳槽、高速台式离心机、真空泵、真空干燥器、抽滤瓶、烧杯、移液管、细长滴管、 研钵、微量注射器、普通注射器、试管、试管架等。3. 试剂：（1）分离胶缓冲液（pH 8.9 Tris-HCl）：称取Tris 36.8g，加1M H

25、Cl 48mL，用无离子水溶解后定容至100mL。（2）分离胶贮液（Acr-Bis）：称取Acr 28.0g，Bis 0.735g，用无离子水溶解后定容至100mL，过滤除去不溶物。（3）隔层胶缓冲液（pH 6.7 Tris-HCl）：称取Tris 5.98g，加1M HCl 48mL，用无离子水溶解后定容至100mL。（4）隔层胶贮液（Acr-Bis）：称取Acr 10g，Bis 2.5g，用无离子水溶解后定容至100mL。（5）2琼脂：称取2g琼脂，用100mL无离子水加热熔化。（6）过硫酸铵溶液：称取0.14g过硫酸铵溶于100mL无离子水中，现用现配。（7）电极缓冲液（pH 8.3 T

26、ris-Gly）：称取Tris 6g、Gly 28.8g，溶于无离子水后定容至1000mL，用前再稀释10倍。（8）40蔗糖溶液：称取蔗糖40g，溶于100mL无离子水中。（9）0.5溴酚蓝溶液：称取0.5g溴酚蓝溶于100mL无离子水中。上述各试剂（除过硫酸铵外）配好后装入棕色瓶于冰箱中可保存12个月。三、操作步骤1. 凝胶的制备（1）将上述试剂贮液自冰箱中取出，置于室温平衡后再配制工作液。（2）取一洗净装好的垂直板电泳槽，在下口处加入适量熔化的2琼脂，静置冷却，待凝固后即封好下口，可用于制胶。（3）分离胶制备：按下表比例配制分离胶。其中过硫酸铵单独放一小烧杯中，其余混匀于另一小烧杯中。然后

27、小心混匀两杯溶液，其中加入TEMED 180L，立即用玻璃棒沿电泳胶槽玻壁灌胶。胶液液面离上限34cm左右停止灌胶，再沿玻壁缓缓加水约0.5cm，以防过量氧气的散入。刚刚加过水可看出界面，后逐渐消失，等再看出界面时，凝胶即已聚合完成。再静置10min左右，将水用滤纸条吸干。贮液名称分离胶缓冲液分离胶贮液过硫酸铵水体积比例双面槽取用量（mL）1921843619（4）隔层胶制备：按下表配制隔层胶溶液。其中核黄素单独放一小烧杯中，其余混匀于另一小烧杯中。然后小心混匀两杯溶液，加入TEMED 120L，将其灌注在分离胶之上约3cm，加胶隔梳子（注意：梳子的底部应与分离胶界面平行），加水封胶。放入人工

28、智能气候室照光，待聚合完成（变成乳白色），轻轻拔出小梳子，边拔边加水。吸出小槽中的水，露出点样槽，准备点样。贮液名称浓缩胶缓冲液浓缩胶贮液核黄素40蔗糖体积比例双面槽取用量（mL）1441614282. 样品制备：称取样品1g，加1mL冰冷的无离子水或电极缓冲液，于冰浴中研磨成匀浆，然后用2mL提取液分几次洗入离心管，在高速台式离心机上10000rpm离心10min。倒出上清液，以等量40蔗糖混合，即为样品制备液。3. 点样：用微量进样器吸取适量的样品制备液，注入样品槽中。一个胶板上一般有1020个点样槽，可用于不同样品的分析，也可用于同一样品不同的分析内容。4. 装槽：点样完毕后，将稀释10

29、倍的电极缓冲液分别注入上、下电极槽中。下槽以没过电极为宜，上槽应浸没胶板上端12cm。上槽加液时要小心操作，以免将样品液冲散出来。然后在上槽中滴加几滴溴酚蓝作为前沿指示剂。5. 电泳：将电泳槽放入层析冷柜，接好电源线，上槽为负极，下槽为正极。打开电源开关，调节电流至每板15mA左右。待样品进入分离胶（约15min）中，调节电流到30mA，此时电压应维持在150V左右，电泳约45h。6. 剥胶：待示踪染料下行到距胶板下端0.5cm处即可关闭电源，停止电泳。然后放出电极缓冲液，剥胶。打开固定螺丝或夹子，取出玻板和胶板，在流水冲刷下，轻轻撬开两层玻板，取出胶板，放入一个大培养皿中，以无离子水浸泡10

30、min，即可开始染色。酶谱技术一、原理同工酶是一系列催化相同反应的蛋白质，因此鉴定同工酶的最适宜的方法是用底物反应。底物被酶作用产生产物，生成的产物或自身就有生色团而显色，或是与适宜的染料结合而生色。因为产物的生成只局限于酶存在的区域，所以色带便是明显的酶带。而同工酶与同一底物反应生成的产物相同，有同样的生色反应，经电泳分离后因结构的差异性可在支持介质上显现出数条酶带，这就是所谓的酶谱。它反映了同工酶存在的数量，而酶带的宽窄以及颜色的深浅则反映了酶的相对活性。（一）过氧化物酶过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，是一含有血红素铁的蛋白质，催化如下的反应：RH2 + H2O2 R + 2H2ORH2可以是大多数的酚类或胺类物质。本实验所用的是联苯胺，显色结果是在无色透明的胶板上形成蓝色的酶带。二、仪器和试剂（一）仪器电泳谱带扫描仪、真空凝胶干燥器、恒温箱、