农杆菌介导转化法的概述

1、学年第学期2014级硕士生生物化学期末论文任课教师: 开课学院: 课程名称: 学 院: 专 业: 学 号: 姓 名:2015年6月20日农杆菌介导转化法的概述摘要：自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为开展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中别离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。 1目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丧失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法

2、是一种天然的植物遗传转化系统，外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术20农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物尤其是水稻中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进展综述。关键词：农杆菌转化方法转化效率1关于农杆菌农杆菌5是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠嘤瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。1.1 根癌农杆菌依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠嘤碱的种类不同， 根癌农杆菌可分为4 种类型：章鱼碱型Octopine、胭脂碱型

3、Nopaline、农杆碱型Agropine和 琥珀碱型Succinamopine。原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区：1.1.1 T-DNA区（TransfeL DNA region）:不同来源的菌株，T-DNA 的长度在 1224 kb,它是在农杆菌侵染细胞时，从 Ti质粒上切割下来转移到植物基因组 中的一段DNA ,其携带的基因与月中瘤的形成有关，但与 T-DNA本身的转移与 整合无关.T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列.其 中14 bp是完全保守的，分10 bp（CAGGAATATAT）和4 bp（GTAA）不连续的2 组.左右2个边界（LB和R

4、B）是T-DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因 此，尤以右边界更为重要。1.1.2 毒性区（vir区）：位于T-DNA以外的1个30-40kb的区域，该区段编码的基 因虽然并不整合进植物基因组中，但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因（vir）。目前，对章鱼碱型农杆菌 Ti质粒pTi15955 和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进展了全序列分析，在章鱼碱型 Ti质 粒的vir区发现了 8个操纵子，分

5、别为virA-vjrH ,共包括23个基因（virA, virB1-virB11, virC1 , virC2, virD1-virD4 , virE1 , virE2, virF, virG , virH）,而胭 脂碱型Ti质粒的vir区不含vjrF和virH操纵子，它含有另一个基因tzs ,也有学 者认为有大约35个vir基因成簇排布于vir区。1.1.3 接合转移区（Con区）：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因（tra）,调 控Ti质粒在农杆菌间转移。1.1.4 复制起始区（ori区）：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了 Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因

6、.染色 体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB.它们大多编码一些膜相关蛋 白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。1.2 发根农杆菌发根农杆菌（Agrobacterium rhizogene令有Ri质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。其侵染植物是将其Ri质粒上的T-DNA插入到宿主植物基因组中， 这一点与Ti质粒相类似。转移机制也类似，所不同的是 vir区和T-DNA区所含 基因及其同源性不同。发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附 着在植物的细胞壁上，virA的产物是一种跨膜蛋白，进一步激活 virG的产物。T-DNA

7、区的TL区具有较高的稳定性，TR区具有与生长素合成有关的基因tmsl 和tms2及农杆碱或甘露碱合成基因。TR区可进展改造，这样Ri通过农杆菌细 胞膜特定”孔道进入宿主植物细胞核，进而使 T-DNA整合到植物基因组中。 2转化过程农杆菌介导的T-DNA的转移和整合是细菌和植物细胞相互作用发生生物学 效应的过程，兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。其转化过程6-8如下：2.1 细菌在植物伤口处附着，使受伤的植物组织产生酚类化合物，诱 导Ti质粒vir基因的表达.在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出酚类化合物信号，如乙酰丁香酮As。当农杆菌承受到此类信号时，其vir区基因可被诱

8、导转录。另一类诱导 化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir 区基因的表达。Vir区基因的活化首先是从virA基因开场的。VirA蛋白是一种结 合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应， 其感应部位可 能位于胞质区域。VirA蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后， 使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结 合到vir启动子的特定区域，从而成为其它 vir基因转录的激活因子，翻开 VirB、 virC、virD、virE、virH 等几个基因。virC、virD、virE 参与 T-DNA 复合体的

9、形 成和转移.ChvE可结合一些单糖，也可直接与 VirA周质区相互作用，以加强 As对Vir基因的诱导。2.2 vir基因表达的产物作用于 T-DNA产生T-DNA链，进而转化形成 T-DNA复合体，随后在植物及细菌蛋白的共同作用下被摄入细胞核。VirD基因编码的两个产物 VirDI和VirD2直接参与加工过程.VirDI蛋白是 一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA变成松弛型DNA . VirD2蛋白具有特异剪 切单链DNA的切酶活性，它可以识别T-DNA底链边界重复序列上的特定位点， 并在底链24 bp重复序列和第四个碱基之间切割，将 T-DNA从Ti质粒上剪切下 来，称T-链。切开T-DN

10、A后，VirD2蛋白与T 一链的5'端共价结合，防止核 酸外切酶降解T 一链.新的T-DNA底链以此链为模板，从右端产生的 DNA缺 口处以5' -3'方向进展合成。被取代的旧链游离出来，与许多 VirE2蛋白分子 结合组成T-DNA复合体。止匕外，VirD2作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA 复合体从农杆菌进入到植物细胞核。2.3 T-DNA整合进入植物基因组并表达产生生物学效应.T-DNA整合进宿主细胞基因组，是转化过程中最重要也最关键的步骤。 T-DNA在寄主细胞染色体上的整合是随机的，但对转录活化区域有所偏好。 T-DNA通过与事先断裂的寄主DNA双链(D

11、SB)发生重组来完成整合，进而进展表达。3转化方法目前农杆菌介导转化单子叶植物最常用的方法是共培养法。 利用农杆菌与植物离体组织共培养进展转化，一般需要经过严格的组织培养过程以再生植株， 因而转 化周期比拟长。共培养前农杆菌感染愈伤组织的方式有：将整块愈伤组织浸泡 于菌液中静置培养。将整块愈伤组织浸泡于菌液中摇动培养。将菌液加至愈伤组织上。通常使用的是第一种方式。现将农杆菌介导的植物遗传转化常采用的方法9,简要介绍如下：3.1 叶盘法选取安康的无菌苗，用打孔器打出叶圆盘，将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有目的基因的农杆菌液进展短期共培养，农杆菌通过伤口使携带外源目的基因的 Ti或 Ri质粒进入植物细

12、胞，使外源目的基因整合到植物基因组中。 它是双子叶植物较 为常用也较为简单有效的方法。3.2 真空渗入法该法转化的强健植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。它 是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的 基因转移方法，具有良好的研究与应用前景。3.3 原生质体法在原生质培养的早期，将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养， 农杆 菌的Ti或Ri就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核，T-DNA就可能 整合在受体基因组上。止匕外，作为载体法，新的转基因方法有：基

13、于 Ac/Ds转座系统建立的转化 载体；利用噬菌体P1Cre-lox位点的特异性重组系统；利用酵母线粒体 I-Scel核酸切酶特异性诱导植物DNA双链断开引起的同源重组系统；利用双链细菌人造 染色体载体系统等，能够提高转化率或转基因位点质量。4研究现状关于禾谷类单子叶植物农杆菌介导的遗传转化，早期的研究多采用其幼胚来 评估不同条件下被农杆菌侵染的可能性。结果显示，T-DNA向禾本科植物中的转化没有明显障碍，但人们对整合过程的了解十分有限，同时存在相当大的争议。 在此根底上，人们利用大量实验去测试不同谷类植物的不同外植体对农杆菌侵染 的反响能力，以期获得稳定的转化细胞或植株。Grimsley等1

14、987首先将玉米条纹病毒(maize streak viruS) cDNA通过根癌农杆菌转入玉米，转入植株表现出 感染病症；Gould等1991用根癌农杆菌感染玉米芽尖，得到少量转基因植株； Shen等1993观察到农杆菌介导的gus基因转入玉米芽后B -葡糖甘酸酶的表达； Mooney等1991采用根癌农杆菌感染小麦胚得到转化细胞；Rainer等1990和Chan等1992通过根癌农杆菌感染未成熟胚得到少量水稻转基因植株。以 上研究工作得到的转化频率很低，且没有足够的分子和遗传证据，这些研究成果 很少为大家承受并成认，却是鼓舞人心的，为单子叶植物尤其是禾谷类作物转基 因研究的进一步开展奠定了

15、根底。1993年-1994年取得了重大突破，Chan等1993 以水稻开花授粉后10-12天的幼胚为受体，经农杆菌感染后获得了转基因植株； Hiei等1997以水稻成熟胚愈伤组织和未成熟幼胚为受体，获得了较多有严格 分子生物学证据的转基因植株，并对农杆菌介导法转化水稻的影响因素进展了详 细研究，建立了比拟成熟的农杆菌转化水稻的技术体系，为农杆菌介导法转化单子叶植物开辟了先河。从此，农杆菌介导法的转化围扩展到了许多重要的单子叶 植物，包括香蕉、玉米、大麦、小麦、甘蔗、大蒜、洋葱、高梁和黑麦Chenget al 1997Ishida et al 199610-135存在问题与展望5.1 植物受体因

16、子与农杆菌间的作用机理目前对农杆菌介导转化的机理及分子调控已研究比拟深入，但对有关植物因子的作用机理还知之甚少。许多研究说明，农杆菌介导单子叶植物遗传转化已具备了 与双子叶植物相似的农杆菌本身的必要条件，但单子叶植物的转化相比拟而言困难得多，这可能不仅是农杆菌一方的因素，单子叶植物的植物因子也可能起着关 键作用，也不排除农杆菌和这些植物因子的相互作用1405.2 转化率大多数单子叶植物的转化受其基因型、外植体来源、组织培养难易程度等因素的影响，比拟难，以至在重要禾谷类作物中的应用受到一定的限制，与双子叶植物相比，农杆菌转化单子叶植物还存在较大差距，其中烟草、葡萄等双子叶植物的转化效率高达60%

17、以上，而单子叶植物中转化效率较高的禾本科植物还不到 30%解玉宝等2005;孟芮等2006）据统计，单子叶植物用农杆菌转化获得成功 的遗传转化率玉米为5%-30%、水稻为29%、粕稻为22%,接近双子叶植物（任永 霞等2005）150目前农杆菌介导遗传转化的方法主要有原生质体法、叶盘法和整 株感染法等。对于大多数单子叶植物的转化，常受基因型、外植体来源、组织培 养难易程度等因素影响而很难成功，因此在许多重要禾谷类作物中的应用受到限 制。5.3 Ti载体容量禾谷类作物的一些性状，如抗病、抗虫、抗逆、高产优质等，或是数量性状，或 是质量性状相关的基因成簇排布，定位在较大的DNA片段。这些性状的改造

18、就 需要一个能将大片段DNA导入植物细胞并稳定表达的转化体系。能携带大片段 DNA的双元细菌人工染色体和具转化功能人工染色体分别对烟草和拟南芥的成 功转化Hamilton et al 1997 Liu et al 1999,无疑对实现禾谷类作物中导入大片 段DNA并进展遗传改进具有重要意义卫等 2000。农杆菌介导的遗传转化也存在缺乏15-16。如农杆菌感染过程会对植物材料造成损伤，T-DNA整合时其边界可能会发生截断Hamid et al 1996, T-DNA以串连形 式整合，基因依赖性较高Lee et al 1999,甲基化等原因造成基因表达失活Kumpalta et al 1997 1

19、99& Pawlowski et al 1998,转移 T-DNA 区的两个基因未 必共表达等Hamid et al 1996。另外，考虑到转基因作物及其产品的平安性问题，培育具有平安选择标记或无选择标记的转基因植物也将成为植物基因工程研究的热点之一。6完毕语随着转基因技术的迅猛推广，农杆菌介导植物遗传转化在转化机理、转化围、 转化方法、转化策略等方面的进一步深入研究，农杆菌介导法已在植物转基因领 域中被广泛应用，成为获得转基因植物最常用的方法。参考文献1翼，路曦结，韩文兵等.转基因技术在我国的研究、应用现状及展望.农学通 报A. 2003 ,9(6) :124-126.2耿立召，传亮，付广等.农杆菌介导法与基因枪轰击法结合在植物遗传转化上 的应用J.西北植物学报，2005, 25(1).3惠展.基因工程M.XX:华东理工大学,2005,3654王关林，方宏筠.植物基因工程MI.:科学，2002: 452-453.5任永霞，季静，王里，王萍.植物遗传转化方法概述J北方学院学报.2005,21(6):38-42.6 Hellens R,Mullineaux P'KLEE H . A guide to Agrobacterium binary Ti vectors Trends in PlantScience 2000. 5: 446-4517 Gelvin SB.A