紫外可见分光光度计技术讲座

1、 技术讲座技术讲座中南大学现代分析测试中心中南大学现代分析测试中心 内容提要第一篇 第二篇 第三篇 光的选择吸收光的选择吸收 当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会被分光会被吸收吸收或被或被反射反射，不同的物质对于照射它们的光束，不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈，对另外的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈，对另外波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。择吸收。 物质呈现出特征的颜色，就是它们对可见光中某些特物质呈现出特征的颜

2、色，就是它们对可见光中某些特定波长的光线选择吸收的缘故。定波长的光线选择吸收的缘故。 一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收行吸收 物质颜色和吸收光颜色的关系物质颜色和吸收光颜色的关系 吸吸 收收 光光 物质颜色物质颜色 颜颜 色色 波波 长长(nm) 黄黄 绿绿 紫紫 400 450 黄黄 蓝蓝 450 480 橙橙 绿绿 蓝蓝 480 490 红红 蓝蓝 绿绿 490 500 紫紫 红红 绿绿 500 560 紫紫 黄黄 绿绿 560 580 蓝蓝 黄黄 580 600 绿绿 蓝蓝 绿绿 600 650 蓝蓝 绿绿 红红 650

3、750 电磁波谱图电磁波谱图 0.01nm 0.1nm 800nm 10m 500m 1cm 波长波长 200nm 400nm 2.5m 25m 1m 光谱光谱 可可区域区域 见见 射线射线 射线射线 紫外光紫外光 光光 红外光红外光 微波微波 无线电波无线电波 分析分析 分光分光方法方法 射线射线 光度光度 核磁共振核磁共振 射线光谱法射线光谱法 光谱法光谱法 紫外光谱法紫外光谱法 法法 红外光谱法红外光谱法 微波光谱法微波光谱法 光谱法光谱法 1m = 104 m = 106nm = 109 入射光入射光I0透射光透射光I 光程长光程长 光源光源透射率透射率 T =I0I检测器检测器LAM

4、BERT-BEERLAMBERT-BEER定定律律此处此处T: 透射率透射率e e: 摩尔消光系数摩尔消光系数l: 光程长光程长 C: 浓度浓度 吸收吸收 A = log = e e C l1T 当一束平行的单色光通过某一均匀溶液时，溶液的吸当一束平行的单色光通过某一均匀溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的长度的乘积成正比。光度与溶液的浓度和光程的长度的乘积成正比。A = log = - log T = e e C l = abc吸光度、透过率与浓度的关系吸光度、透过率与浓度的关系（ （波长、吸收池光程一定）波长、吸收池光程一定）00.20.40.60.8100.511.522.533.5

5、4Abs%T 浓度浓度1TUV应用领域大学科研院所制药化学电机电力、供气光学金属医疗分析实验室其它大学科研院所制药化学电机电力、供气光学金属医疗分析实验室其它应用领域：应用领域： 涉及化学化工、医疗卫生、冶金地质、食品饮料、农业化肥、畜牧水产、机涉及化学化工、医疗卫生、冶金地质、食品饮料、农业化肥、畜牧水产、机械制造、计量科学、环保、制药、生物、材料、石油等领域中的科研、教学、生械制造、计量科学、环保、制药、生物、材料、石油等领域中的科研、教学、生产中的质量控制、原材料和产品检验等各个方面，进行定性分析、定量测定、纯产中的质量控制、原材料和产品检验等各个方面，进行定性分析、定量测定、纯度检查、

6、结构分析、络合物组成及稳定常数测定、动力学研究等等。度检查、结构分析、络合物组成及稳定常数测定、动力学研究等等。UV的测定范围有机化学分析无机化学分析光学测定生物化学分析环境分析色彩測定临床分析有机化学分析无机化学分析光学测定生物化学分析环境分析色彩測定临床分析测定范围：测定范围： 几乎所有的无机元素和在紫外及可见光区有特征吸收的有机物几乎所有的无机元素和在紫外及可见光区有特征吸收的有机物或有机化合物都能用紫外或有机化合物都能用紫外/可见分光光度法进行测定。可见分光光度法进行测定。 紫外紫外/可见分光光度计的基本结构可见分光光度计的基本结构 光源光源 单色器单色器 样品室样品室 检测器检测器

7、控制放大电路控制放大电路 显示器显示器 比色皿比色皿 光电管（或光电池）光电管（或光电池） 放大器放大器 单色光单色光 显示器显示器 单光束紫外单光束紫外/可见分光光度计可见分光光度计 斩光器斩光器 单色光单色光 光电管（或光电池）光电管（或光电池） 放大器放大器 反光镜反光镜 双光束紫外双光束紫外/可见分光光度计可见分光光度计 比色皿比色皿 光电管（或光电池）光电管（或光电池） 斩光器斩光器 放大器放大器单色光单色光 显示器显示器 光电管（或光电池）光电管（或光电池） 准双光束紫外准双光束紫外/可见分光光度计可见分光光度计 S1 准直镜准直镜 切尼尔切尼尔-特纳特纳 G 单色器结构单色器结构

8、 S2 准直镜准直镜第二篇第二篇紫外紫外/ /可见分光光度测定的一般方法可见分光光度测定的一般方法（一）定量分析（一）定量分析一、绝对法一、绝对法 基于朗伯基于朗伯-比尔定律比尔定律A A = = e ebCbC ，当某一物质在一定波长下当某一物质在一定波长下e e（吸吸收系数，可由已知浓度样品通过测量、计算求得）为一常数，比色收系数，可由已知浓度样品通过测量、计算求得）为一常数，比色皿的光程也是已知，也是一个常数皿的光程也是已知，也是一个常数，只要在吸收系数指定的波长处只要在吸收系数指定的波长处测定样品溶液的吸光度值测定样品溶液的吸光度值( (ODOD值值) )，然后由下式求得该样品溶液的浓

9、，然后由下式求得该样品溶液的浓度或含量：度或含量： C C = = A A / / e e b b 二、标准对照法二、标准对照法 在同样条件下，在选定的波长处，分别测定已知浓度标准溶液在同样条件下，在选定的波长处，分别测定已知浓度标准溶液的吸光度值的吸光度值A A标标和样品溶液的吸光度值和样品溶液的吸光度值A A样样，然后由下式求得样品溶，然后由下式求得样品溶液的浓度或含量：液的浓度或含量： C C样样 = = A A样样 A A标标 C C标标三、标准曲线法（包括三、标准曲线法（包括K K因数法）因数法） 最常用的定量分析方法最常用的定量分析方法。即在一定波长（。即在一定波长（maxmax）

10、下测定某下测定某物质的标准系列溶液的吸光度作校正曲线，然后测定样品溶物质的标准系列溶液的吸光度作校正曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由校正曲线求得液的吸光度值，由校正曲线求得样品溶液的浓度或含量。样品溶液的浓度或含量。 所配置的标准系列溶液的吸光度应在所配置的标准系列溶液的吸光度应在0.10.1 1.51.5A Absbs范围内，范围内，吸收测定的精密度可达吸收测定的精密度可达0.5%0.5%。 注意：注意：UV/VisUV/Vis的最低检测浓度与吸收系数、仪器噪声、的最低检测浓度与吸收系数、仪器噪声、基线平直度、光谱带宽有关。而最高检测浓度则与吸收系数、基线平直度、光谱带宽有关。而最高检测

11、浓度则与吸收系数、仪器的杂散光、光谱带宽等有关，吸收系数与光谱带宽有关。仪器的杂散光、光谱带宽等有关，吸收系数与光谱带宽有关。杂散光越小，检测上限越高。杂散光越小，检测上限越高。四、双波长法四、双波长法 标准溶液澄清透明，待测样品浑浊或含有一种与吸收峰临近的干扰成分，对标准溶液澄清透明，待测样品浑浊或含有一种与吸收峰临近的干扰成分，对待测成分主吸收波长的吸光度有叠加影响，干扰成分随待测成分浓度变化或无法待测成分主吸收波长的吸光度有叠加影响，干扰成分随待测成分浓度变化或无法将干扰成分加入标准溶液中，则必须用双波长法扣除这种干扰成分对待测成分吸将干扰成分加入标准溶液中，则必须用双波长法扣除这种干扰

12、成分对待测成分吸光度读数的影响。光度读数的影响。 双波长法是以样品溶液本身作参比，用两束单色光双波长法是以样品溶液本身作参比，用两束单色光1 1和和2 2交替照射到同一交替照射到同一样品溶液上，仪器自动求得吸光度差值样品溶液上，仪器自动求得吸光度差值A A，在一定范围内在一定范围内A A与溶液浓度成正比，与溶液浓度成正比，待测样品与标准溶液在同样条件下测定即可定量。待测样品与标准溶液在同样条件下测定即可定量。双波长法可消除样品溶液的浑双波长法可消除样品溶液的浑浊背景、色度背景，排除临近吸收峰的干扰浊背景、色度背景，排除临近吸收峰的干扰（包括二波长法、等吸收点法和系数（包括二波长法、等吸收点法和

13、系数倍率法）。倍率法）。 1 2 1 2 如：核酸（如：核酸（DNADNA、RNARNA）的测定的测定(260(260nm,280nmnm,280nm或或230230nm,260nm, 280nm)nm,260nm, 280nm)也也是双波长或三波长测定法是双波长或三波长测定法。五、多波长法五、多波长法六、多波长多组分定量法六、多波长多组分定量法七、导数光谱法七、导数光谱法 导数光谱法由于能提高方法的灵敏度，改善方法选择性，有效的消除基导数光谱法由于能提高方法的灵敏度，改善方法选择性，有效的消除基体干扰，尤其适合浑浊试样和进行多组分同时测定。体干扰，尤其适合浑浊试样和进行多组分同时测定。八、八

14、、 化学计量学光度法化学计量学光度法 人工神经网络人工神经网络- -分光光度法分光光度法 模糊聚类模糊聚类- -偏最小二乘光度法偏最小二乘光度法 小波变换小波变换- -偏最小二乘法偏最小二乘法九、固相光度法九、固相光度法 固相光度法是将有色络合物吸附或萃取在固相（如树脂，泡沫塑料，结固相光度法是将有色络合物吸附或萃取在固相（如树脂，泡沫塑料，结晶萘，石蜡等）离子交换树脂上，再在固相进行光度测定。固相光度法是集晶萘，石蜡等）离子交换树脂上，再在固相进行光度测定。固相光度法是集分离、富集、测试于一体，不仅简化了试验过程，也大大提高了灵敏度和选分离、富集、测试于一体，不仅简化了试验过程，也大大提高了

15、灵敏度和选择性。择性。 另外，还有比吸收系数法、示差分光光度法等，因常规测定应用较少，另外，还有比吸收系数法、示差分光光度法等，因常规测定应用较少，这里不作详细讨论。这里不作详细讨论。十、动力学光度法十、动力学光度法 即时间扫描方式测定。是光度计的吸光度（即时间扫描方式测定。是光度计的吸光度（Abs）、）、透过率（透过率（%T）随时间变随时间变化的一种动态测量方式。化的一种动态测量方式。 主要用于酶机理研究、酶活性测定、元素分析及化学反应机理的研究等。主要用于酶机理研究、酶活性测定、元素分析及化学反应机理的研究等。动动力学光度法因其特有的高灵敏度在光度分析中占有重要地位。动力学光度法可分力学光

16、度法因其特有的高灵敏度在光度分析中占有重要地位。动力学光度法可分为三种类型：为三种类型：（1）催化动力学光度法，）催化动力学光度法，这是最主要的也是最常用的动力学光度这是最主要的也是最常用的动力学光度法，系利用被测离子催化显色体系的显色反应或褪色反应进行测定，近年来，利法，系利用被测离子催化显色体系的显色反应或褪色反应进行测定，近年来，利用催化反应测定的论文呈现非常明显的上升之势。其测定范围已包括许多过渡金用催化反应测定的论文呈现非常明显的上升之势。其测定范围已包括许多过渡金属、贵金属、非金属和无机阴离子。涉及的元素有属、贵金属、非金属和无机阴离子。涉及的元素有Ag、Al、AS、Au、Bi、B

17、r、Ca、Cd、Ce、Co、Cr、Cu、Eu、F、Fe、Hg、I、Mn、Mo、Ni、Os、Pb、Pt、Pd、Re、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Sr、Te、Ti、Tl、Th、U、V、Zn等。涉及的阴离子有等。涉及的阴离子有SCN-、BrO3-、NO2-、NO3-。（2）诱导动力学光度法诱导动力学光度法，系利用某一转化反应来诱导另一转化反应，借以进行光度测定。系利用某一转化反应来诱导另一转化反应，借以进行光度测定。（3）速差动力）速差动力学光度法学光度法，是利用性质相近的不同离子在同一显色体系中反应速率常数的差异，是利用性质相近的不同离子在同一显色体系中反应速率常数的差异，对其分别进行

18、光度测定。对其分别进行光度测定。 ABS ABS ABS ABS (%T) (%T) (%T) (%T) 时间时间 时间时间（二）定性分析（二）定性分析一、利用标准物质定性一、利用标准物质定性 在相同条件下，用光谱扫描法测定未知物的吸收光谱，与所推断化合物的标在相同条件下，用光谱扫描法测定未知物的吸收光谱，与所推断化合物的标准物的吸收光谱进行比较，如果两吸收光谱的形状和吸收峰的数目、位置、拐点准物的吸收光谱进行比较，如果两吸收光谱的形状和吸收峰的数目、位置、拐点等完全一致，就可初步判定未知物与标准物是同一种物质。但要注意，物质不同等完全一致，就可初步判定未知物与标准物是同一种物质。但要注意，物

19、质不同但光谱相似的特殊情况。但光谱相似的特殊情况。二、用波长位置判断有机化合物的生色基团二、用波长位置判断有机化合物的生色基团 例如，若发现在例如，若发现在210210 250250nmnm有强吸收峰，则可能有双键并处在共扼状态。在有强吸收峰，则可能有双键并处在共扼状态。在260260nmnm、300nm300nm、330nm330nm有高强度的吸收带，表示有有高强度的吸收带，表示有3 3 5 5个共扼单位，如在个共扼单位，如在270270 300300nmnm之间有弱吸收之间有弱吸收( (e e=10=10 100)100)，表示有羟基的存在；在，表示有羟基的存在；在250250 30030

20、0nmnm之间之间有中强度吸收有中强度吸收( (e=1000 e=1000 10000)10000)，表示有笨环存在等，表示有笨环存在等。（三）纯度检查（三）纯度检查 主要用于检查对光没有特征吸收的化合物中的具有特征吸收的杂质。主要用于检查对光没有特征吸收的化合物中的具有特征吸收的杂质。 如检查乙醇中醛的量，可用蒸馏水作参比，在如检查乙醇中醛的量，可用蒸馏水作参比，在270270 290290 nm处测量吸处测量吸光度，如在光度，如在280280nmnm处有吸收，表示有醛。处有吸收，表示有醛。 双波长或三波长核酸（双波长或三波长核酸（DNADNA、RNARNA）的测定时，根据的测定时，根据A

21、A260260 / A / A280280的比值的比值可确定可确定DNADNA或或RNARNA的纯度。对于的纯度。对于DNADNA，比值为比值为1.6 1.6 1.81.8之间之间, ,RNARNA比值为比值为1.8 1.8 2.02.0之间之间, ,认为纯度较高。认为纯度较高。 又如四氯化碳中，最主要的杂质是二硫化碳（又如四氯化碳中，最主要的杂质是二硫化碳（CSCS2 2）。）。二硫化碳杂质二硫化碳杂质的多少，衡量产品质量的好坏。二硫化碳在紫外区的的多少，衡量产品质量的好坏。二硫化碳在紫外区的318318nmnm处有一个很强处有一个很强的吸收峰。因此，只要检查的吸收峰。因此，只要检查3183

22、18nmnm处二硫化碳吸收峰的大小，就可知道四处二硫化碳吸收峰的大小，就可知道四氯化碳产品是否合格。氯化碳产品是否合格。（四）固体样品的分析（四）固体样品的分析 固体样品分析的配件主要有：积分球、镜面反射装置、固体样品支架、凝胶固体样品分析的配件主要有：积分球、镜面反射装置、固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架等。扫描装置及凝胶薄膜支架等。 积分球是利用固体样品的正反射（入射光按以法线为中心的对称角度反射，积分球是利用固体样品的正反射（入射光按以法线为中心的对称角度反射，称镜面反射）或漫反射（入射光向各方向反射）的特性进行分析的装置。称镜面反射）或漫反射（入射光向各方向反射）的特性进行分析

23、的装置。 镜面反射装置主要用于半导体、光学材料的反射率测试。镜面反射装置主要用于半导体、光学材料的反射率测试。 固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架用于光学玻璃、电泳胶条等固体样品支架、凝胶扫描装置及凝胶薄膜支架用于光学玻璃、电泳胶条等的测定。的测定。 积分球、镜面反射装置是利用光的反射原理进行定性、定量测定。如配备积分球、镜面反射装置是利用光的反射原理进行定性、定量测定。如配备有透射样品池架，也可进行样品溶液的透射测定。如配备大内径积分球有透射样品池架，也可进行样品溶液的透射测定。如配备大内径积分球（150mm150mm）可测定粉状、纸、布料及溶液等样品的反射透射光谱，同时最适合可测定粉

24、状、纸、布料及溶液等样品的反射透射光谱，同时最适合于色彩分析。于色彩分析。参比光束参比光束 I I0 0 倒置型倒置型 标准白板标准白板 光电倍增管光电倍增管 样品样品样品光束样品光束 积分球示意图积分球示意图（五）结构分析（五）结构分析 紫外紫外/可见分光光度计可用来判别物质的异构可见分光光度计可用来判别物质的异构体，如互变异构体、顺反异构体等。体，如互变异构体、顺反异构体等。第三篇影响紫外仪器质量的几个重要指标一、光度准确度与重复性一、光度准确度与重复性定义：定义：多次测量平均值与真值之差为光度准确度（多次测量平均值与真值之差为光度准确度（T 、 A）；）；最大值与最小最大值与最小值之差为

25、光度重复性。偏差越小，准确度越高。光度准确度和光度重复性是值之差为光度重复性。偏差越小，准确度越高。光度准确度和光度重复性是非常非常重要的技术指标重要的技术指标，直接关系到测试结果的准确性。，直接关系到测试结果的准确性。 光度准确度在不同的吸光度范围是不同的，因此光度准确度的表示一定要指光度准确度在不同的吸光度范围是不同的，因此光度准确度的表示一定要指出在多少吸光度或在多少出在多少吸光度或在多少透射比情况下测试的。透射比情况下测试的。影响影响光度准确度的主要因素有：光度准确度的主要因素有： 仪器的杂散光大小。仪器的杂散光大小。 仪器的光谱带宽仪器的光谱带宽 仪器的光度噪声仪器的光度噪声 试样的

26、制备试样的制备 仪器的基线平直度仪器的基线平直度 比色皿的性能比色皿的性能 光度准确度的检查光度准确度的检查: 一般用标准滤色片或一般用标准滤色片或的的重铬酸钾的重铬酸钾的0.0050.005mol/L Hmol/L H2 2SOSO4 4溶液。溶液。酸性重铬酸钾溶液的标准吸收值如下：酸性重铬酸钾溶液的标准吸收值如下： 吸吸 光光 度度 测量波长测量波长( (nm) nm) 溶液溶液A (50mg/L KA (50mg/L K2 2CrCr2 2O O7 7) ) 溶液溶液B (100mg/L KB (100mg/L K2 2CrCr2 2O O7 7) ) 235 235（谷）谷） 0.62

27、6 0.626 0.09 1.251 0.09 1.251 0.019 0.019 257 257（峰）（峰） 0.727 0.727 0.007 1.454 0.007 1.454 0.015 0.015 313 313（谷）（谷） 0.244 0.244 0.004 0.488 0.004 0.488 0.007 0.007 350 350（峰）（峰） 0.536 0.536 0.005 1.071 0.005 1.071 0.011 0.011图1 透光度误差T与吸光度相对误差A/A0和吸光度真值A0的关系图1 透光度误差T与吸光度相对误差A/A0和吸光度真值A0的关系0.000.010

28、.020.030.040.050.060.070.080.090.102.42.22.01.81.61.41.21.00.80.60.40.20.0A0A/A0-0.005T-0.004T-0.003T-0.002T-0.001T-0.0005T二、杂散光二、杂散光定义：定义：单色器额定通带以外的透射辐射能量与总的透射能量之比，也就是光谱通单色器额定通带以外的透射辐射能量与总的透射能量之比，也就是光谱通带以外带以外“不要的不要的”光通量就是杂散光。光通量就是杂散光。 杂散光是一个非常重要的关键技术指标，它是紫外杂散光是一个非常重要的关键技术指标，它是紫外/可见分光光度计分析误可见分光光度计分析

29、误差的主要来源，差的主要来源，直接限制被分析测试样品的上限。直接限制被分析测试样品的上限。当仪器的杂散光一定时，被分当仪器的杂散光一定时，被分析样品的浓度越大，其分析误差就越大。析样品的浓度越大，其分析误差就越大。 杂散光的主要来源：杂散光的主要来源： 1 1、灰尘沾污光学元件。灰尘沾污光学元件。 2 2、光学元件被损伤。、光学元件被损伤。 3 3、准直系统内部或有关隔板边缘的反射。、准直系统内部或有关隔板边缘的反射。 4 4、光学系统屏蔽不好。、光学系统屏蔽不好。 5 5、热辐射或荧光引起的二次电子反射。、热辐射或荧光引起的二次电子反射。 6 6、狭逢的缺陷。、狭逢的缺陷。 7 7、光学系统

30、的像差。、光学系统的像差。、 8 8、单色器内壁黑化处理不当。、单色器内壁黑化处理不当。 光栅是杂散光的主要来源，占总杂散光的光栅是杂散光的主要来源，占总杂散光的80%80%。测定方法：测定方法：一般采用标准滤光片或一般采用标准滤光片或10g/L的的NaI及及NaNO3水溶液。在紫外区测定水溶液。在紫外区测定220nm(NaI)或或340nm(NaNO3)处的透过率处的透过率%T ，在可见光区用在可见光区用384mg/L的的KMnO4 ，测定测定525nm处的透过率处的透过率%T 。图1 杂 散光S 与吸光度 相对误差A / A 0 和吸光度真值A 0 的关 系0.000.010.020.03

31、0.040.053.43.23.02.82.62.42.22.01.81.61.41.21.00.80.60.40.20.0A0A /A00.005S0.004S0.003S0.002S0.001S0.0005S0.0004S0.0003S0.0002S0.00015S0.0001S0.00005S 不同程度杂散光对比尔定律的偏离不同程度杂散光对比尔定律的偏离0.1%T三、噪声三、噪声定义：定义： 无样品时仪器自身的波动。无样品时仪器自身的波动。 也就是说：噪声是叠加在待测量的分析信号中不需要的信号，也就是说：噪声是叠加在待测量的分析信号中不需要的信号，即零信号上下波动的振幅宽度。即零信号上下波动的振幅宽度。重要性：重要性： 光度噪声影响光度测量的灵敏度（信噪比）、精密度和准确光度噪声影响光度测量的灵敏度（信噪比）、精密度和准确度。度。限制测定浓