模块四--逆境胁迫对植物生理生化指标的

1、L/O/G/O2021/8/141逆境胁迫对植物生理生化指标的影响李忠光，李忠光，2011.5.25模块四模块四 综综 合合 性性 实实 验验2021/8/142目目 的的 掌握逆境胁迫下一些植物生理指标的测定方法；掌握逆境胁迫下一些植物生理指标的测定方法； 了解逆境胁迫下植物生理生化指标的变化以及逆境伤害和了解逆境胁迫下植物生理生化指标的变化以及逆境伤害和适应的原因。适应的原因。2021/8/143流流 程程 图图玉米幼苗玉米幼苗盐胁迫盐胁迫高温胁迫高温胁迫干旱胁迫干旱胁迫重金属重金属胁迫胁迫低温胁迫低温胁迫发芽率发芽率脯氨酸脯氨酸（Pro）GSH可溶性糖可溶性糖H2O2丙二醛丙二醛（MDA

2、）水涝胁迫水涝胁迫抗氧化酶抗氧化酶(POD)呼吸速率呼吸速率2021/8/144根据生物膜透性根据生物膜透性根据呼吸作用根据呼吸作用染料法染料法纸上荧光法：种皮的透性，十字花科纸上荧光法：种皮的透性，十字花科5%红墨水染色法红墨水染色法0.1%靛蓝、曙红等染色法靛蓝、曙红等染色法TTC法法:作为作为H受体受体BTB法：外界法：外界pH的变化的变化I2-KI染色法：松、衫科种子染色法：松、衫科种子实实 验验 原原 理理 I2021/8/145实实 验验 原原 理理 II4260 nm2021/8/146实实 验验 原原 理理 III2021/8/147实实 验验 原原 理理 IV2021/8/1

3、48实实 验验 原原 理理 V2021/8/149实实 验验 原原 理理 VIPODPPO2021/8/1410实实 验验 原原 理理 VII2021/8/1411实实 验验 方方 法法 I 种子发芽率的测定种子发芽率的测定：各取：各取50粒吸胀的玉米种子或小粒吸胀的玉米种子或小麦种子麦种子沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：粒），进行下列实验： 其中其中50个半粒进行个半粒进行TTC染色（染色（30水浴水浴 20 min） 另另50个半粒进行曙红染色（室温染色个半粒进行曙红染色（室温染色10 min） 根据两种方法的染色情况，分别计算发

4、芽率。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。2021/8/1412 品种为晴品种为晴3或鲁玉或鲁玉13的玉米种子（购于西山种子公司）的玉米种子（购于西山种子公司） 用用0.1% HgCl2消毒消毒10 min后后 用蒸馏水漂洗干净用蒸馏水漂洗干净 用蒸馏水用蒸馏水于于26下吸涨下吸涨12 h 播于垫有播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm16cm）中）中 于于26下暗萌发下暗萌发60 h 计算发芽率（注计算发芽率（注意与前面结果比较）意与前面结果比较） 选取长势一致的玉米幼苗做干旱、高温、选取长势一致的玉米幼苗做干旱、高温、盐渍或低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗

5、）。盐渍或低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。实实 验验 方方 法法 I2021/8/1413 呼吸作用的测定：呼吸作用的测定： 材料的准备：材料的准备：将预测量的材料称重后（将预测量的材料称重后（0.5g）放入测量瓶。）放入测量瓶。 测定方法测定方法：打开电源预热：打开电源预热5 min打开气泵开关打开气泵开关打开闭路打开闭路开关开关用碱石灰管分别连接面板上的用碱石灰管分别连接面板上的“OUT”和和“IN”， 主机主机的的“OUT1”和和“IN1”分别与测量瓶的分别与测量瓶的“OUT1”和和“IN1”相连相连立即开始记时立即开始记时测量测量1min1min的的COCO2 2增加量增加量

6、计算计算：每分钟每克材料的：每分钟每克材料的CO2释放量（释放量（mL.g-1.min-1）。）。实实 验验 方方 法法 II2021/8/1414 Pro的提取的提取：分别取：分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘实验组和对照组的胚芽鞘加入加入3 mL 3%磺基水杨酸（磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂）和少许石英砂充分研磨充分研磨用用2 mL 3% SSA洗研钵洗研钵5000 rpm离心离心10 min 上清液定容至上清液定容至5 mL。 测定测定：上清液各：上清液各2 mL 分别加入分别加入2 mL冰乙酸和冰乙酸和2 mL茚三酮试茚三酮试剂剂煮沸煮沸15 min冷却后冷却后5000 rpm

7、离心离心10 min 分别测定分别测定A520 计算计算：用总显VVVWLA520Pro content = (mmol.g-1FW)实实 验验 方方 法法 III2021/8/1415 MDA提取提取：分别取：分别取0.5 g实验组和对照组实验组和对照组加入加入3 mL 50mM PBS (pH=7.8)和少许石英砂和少许石英砂充分研磨充分研磨用用2 mL PBS洗研钵洗研钵5000 rpm离心离心10 min 上清液定容至上清液定容至5 mL。 测定测定：分别取上清液各分别取上清液各2 mL 加入加入0.6%TBA（用（用0.6% TCA配制）配制） 2 mL煮沸煮沸12 min冷却后冷却

8、后5000 rpm离心离心10 min 分别测定分别测定OD450和和OD532 计算计算：实实 验验 方方 法法 IV2021/8/1416 H2O2提取提取：分别取：分别取0.5 g实验组和对照组实验组和对照组加入加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，内含，内含1mM HA)和少许石英砂和少许石英砂充分研磨充分研磨用用2 mL PBS洗研钵洗研钵5000 rpm离心离心10 min 上清液定容至上清液定容至5 mL。 测定测定：分别取上清液各分别取上清液各3 mL 加入加入0.1%Ti(SO4)2 用用20%(v/v) H2SO4配制配制 1 mL摇匀摇匀 5000 rpm离心

9、离心10 min OD410 计算计算：用总显VVVWLA410H2O2 content = (mmol.g-1FW)实实 验验 方方 法法 V2021/8/1417实实 验验 方方 法法 VI 1、抗氧化酶的提取、抗氧化酶的提取：分别取：分别取0.5 g实验材料实验材料加入少许石加入少许石英砂和英砂和3 ml提取液（提取液（50mmol/L PBS, pH5.8,内含内含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨充分研磨转入离心管中转入离心管中用用2 ml提取液洗研钵提取液洗研钵 5000 rpm离心离心10 min 上清液定容至上清液定容至5 ml 用于测定用于测定POD和和PP

10、O酶活性或分装后转至酶活性或分装后转至-20或或-80保存。保存。 2021/8/14182、POD测定测定：取：取POD反应混合液（反应混合液（10mmol/L愈创木酚，愈创木酚，5 mmol/L H2O2, ,用用PBSPBS溶解）溶解）3.00 ml3.00 ml，加入酶液，加入酶液100 m ml（空白调（空白调零用零用PBSPBS取代），立即记时，摇匀，读出反应取代），立即记时，摇匀，读出反应3 min时的时的A A470470。3、PPO测定测定：取：取PPO反应混合液（反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用邻苯二酚，用PBS溶解）溶解）2.8 ml，加入酶液，加入酶液0.2

11、 ml（空白调零用（空白调零用PBS取代），取代），立即记时，摇匀，立即记时，摇匀，读出反应读出反应 2 min时的时的A410。 以每分钟以每分钟A A值变化值变化0.010.01所需要的酶液的量为一个活力单位所需要的酶液的量为一个活力单位（U U），），则：则：实实 验验 方方 法法 VI2021/8/1419用总显VVVtWA470POD activities = (m mmol.g-1FWmin-1)用总VVtWA01. 0410PPO activities = (U.g-1FW)4、计算、计算实实 验验 方方 法法 VI2021/8/1420实实 验验 方方 法法 VIIGSH的提取：分别取的提取：分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘实验组和对照组的胚芽鞘加入加入3 mL 5%三氯三氯乙酸（乙酸（TCA）和少许石英砂）和少许石英砂充分研磨充分研磨用用2 mL 5% TCA洗研钵洗研钵 5000 rpm离心离心10 min 上清液定容至上清液定容至5 mL。测定：上清液各测定：上清液各1 mL 分别加入分别加入1 mL0.1M PBS (pH=7.7) 0.5 mL 4 mM DTNB (用用0.1M pH6.8PBS现配，空白用此现配，空白用此PBS代替代替) 25 5 min测定测定A412计算：计算：用总显V