第六章 原生质体培养

1、第六章第六章 原生质体培养原生质体培养原生质体（原生质体（protoplast）：植物细胞中，除细）：植物细胞中，除细胞壁以外的成分胞壁以外的成分原生质体研究的意义原生质体研究的意义：1、研究植物细胞壁的形成、研究植物细胞壁的形成2、实现细胞融合和细胞杂交、实现细胞融合和细胞杂交3、实现细胞对外源基因、实现细胞对外源基因、DNA片段、细胞器、片段、细胞器、染色体的捕获染色体的捕获原生质体为植物遗传工程研究提供了一个方便原生质体为植物遗传工程研究提供了一个方便的遗传操作实验系统的遗传操作实验系统第一节第一节 原生质体研究概况原生质体研究概况分离原生质体的方法分离原生质体的方法1、机械法、机械法叶

2、肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，完全脱发生质壁分离，原生质体收缩成球形，完全脱离细胞壁。剪碎组织，可释放原生质体。离细胞壁。剪碎组织，可释放原生质体。缺点：产量低，无法从分生组织分离原生质体。缺点：产量低，无法从分生组织分离原生质体。2、酶法（在第二节详述）、酶法（在第二节详述）1960，Cocking最先采用最先采用原生质体培养的成果原生质体培养的成果1971，Nagata和和Takebe从培养的烟草叶肉细从培养的烟草叶肉细胞原生质体获得完整的再生植株胞原生质体获得完整的再生植株我国学者在我国学者在50多种植

3、物上首先获得原生质体多种植物上首先获得原生质体再生植株，并得到多种植物的细胞杂种再生植株，并得到多种植物的细胞杂种中科院植物所、遗传所、上海植物生理研究中科院植物所、遗传所、上海植物生理研究所做出了重要贡献。所做出了重要贡献。第二节第二节 原生质体分离原生质体分离1、材料选择及预处理、材料选择及预处理双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的切段切段通常被用来制备原生质体通常被用来制备原生质体禾谷类植物，疏松易碎的愈伤或悬浮培养禾谷类植物，疏松易碎的愈伤或悬浮培养的细胞的细胞是制备原生质体的理想材料是制备原生质体的理想材料预处理目的：改变细胞和细胞壁的生理状预处理

4、目的：改变细胞和细胞壁的生理状态，增加细胞膜的强度，提高酶解效率，态，增加细胞膜的强度，提高酶解效率，减少原生质体损伤。减少原生质体损伤。预处理方法预处理方法1、枝条暗处理、枝条暗处理 获得的原生质体有活力，并能继续分裂。获得的原生质体有活力，并能继续分裂。2、叶片萎蔫处理、叶片萎蔫处理 有利于撕除下表皮和原生质体分离有利于撕除下表皮和原生质体分离3、叶片预培养、叶片预培养 叶片撕掉下表皮，在诱导愈伤的培养基上预培养叶片撕掉下表皮，在诱导愈伤的培养基上预培养一段时间，再酶解脱壁，原生质体分裂频率提高很多。一段时间，再酶解脱壁，原生质体分裂频率提高很多。4、预先质壁分离处理、预先质壁分离处理 先

5、在糖溶液中质壁分离，再酶解去壁，可加快原先在糖溶液中质壁分离，再酶解去壁，可加快原生质体释放，提高其活力。生质体释放，提高其活力。5、胚性愈伤和悬浮细胞系的预培养、胚性愈伤和悬浮细胞系的预培养 新鲜培养基中预培养一段时间再分离原生质体，新鲜培养基中预培养一段时间再分离原生质体，质量好，分裂频率高。质量好，分裂频率高。制备原生质体的酶类制备原生质体的酶类纤维素酶：自绿色木霉提取纤维素酶：自绿色木霉提取果胶酶：自根霉提取，将植物组织解析为单个细胞果胶酶：自根霉提取，将植物组织解析为单个细胞崩溃酶：同时具有纤维素酶和果胶酶活性，用于从崩溃酶：同时具有纤维素酶和果胶酶活性，用于从根尖细胞和培养细胞分离

6、原生质体根尖细胞和培养细胞分离原生质体半纤维素酶半纤维素酶蜗牛酶：对孢粉素和木质素均有一定分解能力，可蜗牛酶：对孢粉素和木质素均有一定分解能力，可从花粉母细胞、四分体、小孢子或较老的植物组从花粉母细胞、四分体、小孢子或较老的植物组织分离原生质体织分离原生质体酶溶液的配制酶溶液的配制 为保持释放出的原生质体的活力和膜稳定性，要为保持释放出的原生质体的活力和膜稳定性，要求酶液满足以下条件：求酶液满足以下条件：1、酶液渗透压必须与处理细胞的渗透压相似酶液渗透压必须与处理细胞的渗透压相似同一种植物，子叶和下胚轴游离原生质体时需要的渗透同一种植物，子叶和下胚轴游离原生质体时需要的渗透压最高，愈伤次之，胚

7、性悬浮细胞要求最低。压最高，愈伤次之，胚性悬浮细胞要求最低。可用原生质体培养基做溶剂，其渗透压合适。可用原生质体培养基做溶剂，其渗透压合适。2、酶液添加酶液添加CaCl2 2H2O, KH2PO4和葡聚糖硫酸钾和葡聚糖硫酸钾以提以提高原生质体膜的稳定性。还可加入高原生质体膜的稳定性。还可加入AgNO3减少酶解产减少酶解产生的乙烯生的乙烯，加入过氧化物歧化酶减轻加入过氧化物歧化酶减轻O2自由基对细胞自由基对细胞膜损伤膜损伤，从而提高原生质体植板率。，从而提高原生质体植板率。3、MES（吗啉乙基磺酸）作为（吗啉乙基磺酸）作为pH缓冲调节剂对于保持缓冲调节剂对于保持酶解物的酸碱环境起缓冲作用酶解物的

8、酸碱环境起缓冲作用，增加原生质体的释放，增加原生质体的释放量和稳定性。量和稳定性。4、酶溶液最适酶溶液最适pH范围为范围为5.45.8 酶液配好后，过滤灭菌备用。酶液配好后，过滤灭菌备用。 原生质体制备原生质体制备材料和酶液体积比：材料和酶液体积比：1：10酶解时间因材料而异酶解时间因材料而异酶解温度酶解温度2530黑暗或弱光下酶解黑暗或弱光下酶解静置或摇床上酶解静置或摇床上酶解原生质体活力检测方法原生质体活力检测方法1、形态：来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色，叶绿体、形态：来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色，叶绿体及细胞内小颗粒在不停运动；来自愈伤或悬浮细胞的及细胞内小颗粒在不停运动；来自愈伤

9、或悬浮细胞的原生质体，可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状原生质体，可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状内含物布朗运动快慢来判断。内含物布朗运动快慢来判断。2、染色：、染色：1酚番红或伊文斯兰染色检测，活的原生质酚番红或伊文斯兰染色检测，活的原生质体不着色，死的立即染色。体不着色，死的立即染色。3、FDA（Fluorescein diacetate，荧光素双醋酸盐），荧光素双醋酸盐） 活体活体染色染色：FDA能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解为不能排出的，累积在质膜内的荧光素。在荧光显微为不能排出的，累积在质膜内的荧光素。在荧光显微镜下观察时，凡发淡绿荧光

10、的都是活的原生质体。镜下观察时，凡发淡绿荧光的都是活的原生质体。4、CFW（荧光增白剂）染色法：新细胞壁再生产生绿（荧光增白剂）染色法：新细胞壁再生产生绿色荧光色荧光第三节第三节 原生质体培养原生质体培养1、供体材料：单双子叶植物有所不同、供体材料：单双子叶植物有所不同2、培养基、培养基 无机盐：无机盐：大幅度降低铵离子浓度，可以只用硝态氮，同时附加有大幅度降低铵离子浓度，可以只用硝态氮，同时附加有机氮源。机氮源。钙离子浓度可适当增加，提高原生质体膜稳定性。钙离子浓度可适当增加，提高原生质体膜稳定性。碳源和渗透压：碳源和渗透压：葡萄糖最适合葡萄糖最适合，应过滤消毒。原生质体培养，必须，应过滤消

11、毒。原生质体培养，必须提供一个等渗或稍低于细胞内渗透压的外界环境。提供一个等渗或稍低于细胞内渗透压的外界环境。有机附加物和激素：有机附加物和激素：VBVB1 1、VBVB6 6、烟酸是必需的、烟酸是必需的。很多时候，只需要很多时候，只需要生长素，尤其生长素，尤其2,4-D2,4-D条件培养基：液体培养基培养生长迅速的细胞一段时间后，除去细条件培养基：液体培养基培养生长迅速的细胞一段时间后，除去细胞的培养液胞的培养液pHpH：5.65.65.85.8，以，以MESMES、葡聚糖硫酸钾等调节、葡聚糖硫酸钾等调节常用基本培养基：常用基本培养基：KM8pKM8p和和NTNTKM8pKM8p：高国楠建立

12、，用于豆科和禾谷类原生质体培养：高国楠建立，用于豆科和禾谷类原生质体培养NTNT：双子叶植物原生质体培养：双子叶植物原生质体培养 培养基通常过滤消毒培养基通常过滤消毒 培养的原生质体密度培养的原生质体密度 培养单个原生质体之前，最好在高密度下培养数天。培养单个原生质体之前，最好在高密度下培养数天。原生质体的培养方法原生质体的培养方法培养方式：培养方式： 固体培养：琼脂或平板培养。可定点观察一个原生质固体培养：琼脂或平板培养。可定点观察一个原生质体的再生、生长和分裂，但分裂慢，操作繁琐。体的再生、生长和分裂，但分裂慢，操作繁琐。 液体浅层培养：简单，对原生质体损伤小，易于添加液体浅层培养：简单，

13、对原生质体损伤小，易于添加新鲜培养基和转移培养物，但原生质体分布不均，易新鲜培养基和转移培养物，但原生质体分布不均，易粘连，难以定点追踪。粘连，难以定点追踪。 微滴培养（微滴培养（droplet culture):droplet culture):可进行多组合试验，可进行多组合试验，可进行融合体及单个原生质体培养和观察。但易挥发，可进行融合体及单个原生质体培养和观察。但易挥发，可覆盖矿物油。可覆盖矿物油。 滋养培养（滋养培养（nurse culture):nurse culture):利用能分泌生物活性物利用能分泌生物活性物质的细胞或组织培养物作为滋养者，促进原生质体的质的细胞或组织培养物作为

14、滋养者，促进原生质体的分裂和生长。分裂和生长。第四节第四节 原生质体再生植株的遗传性状及变异原生质体再生植株的遗传性状及变异一般由茎尖、叶肉、胚性组织细胞分离一般由茎尖、叶肉、胚性组织细胞分离的原生质体能较好保持原来的倍性的原生质体能较好保持原来的倍性悬浮培养细胞特别是长期继代培养的细悬浮培养细胞特别是长期继代培养的细胞分离的原生质体较易出现染色体倍性胞分离的原生质体较易出现染色体倍性及数目的变化及数目的变化变异可能是材料本身存在的，也可能是变异可能是材料本身存在的，也可能是长期无性繁殖发生的。长期无性繁殖发生的。第五节 性细胞原生质体培养进展精细胞分离精细胞分离三细胞花粉：禾本科与十字花科植

15、物，花粉中含有三细胞花粉：禾本科与十字花科植物，花粉中含有一个营养细胞和两个游离在营养细胞的细胞质中的一个营养细胞和两个游离在营养细胞的细胞质中的精细胞，为三细胞花粉精细胞，为三细胞花粉二细胞花粉：茄科和百合科植物，花粉中有一个营二细胞花粉：茄科和百合科植物，花粉中有一个营养细胞和一个生殖细胞，为二细胞花粉。花粉萌发养细胞和一个生殖细胞，为二细胞花粉。花粉萌发后，生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精子。后，生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精子。三细胞花粉，可以直接从成熟花粉中分离精子；二三细胞花粉，可以直接从成熟花粉中分离精子；二细胞花粉，需要先进行花粉的离体培养，待精子形细胞花粉，需要先进行花粉的

16、离体培养，待精子形成后，再从花粉管中分离精子。成后，再从花粉管中分离精子。三细胞花粉的精细胞分离三细胞花粉的精细胞分离1、渗透压冲击法：花粉置于低渗溶液中，吸水破裂，释、渗透压冲击法：花粉置于低渗溶液中，吸水破裂，释放出精细胞。经低速离心，得到精细胞。放出精细胞。经低速离心，得到精细胞。 优点：花粉壁碎片大，易于过滤清除。优点：花粉壁碎片大，易于过滤清除。 缺点：渗透压突然变化对精子生理状态不利。缺点：渗透压突然变化对精子生理状态不利。2、研磨法：成熟花粉悬浮于适当溶液中，研磨使花粉破、研磨法：成熟花粉悬浮于适当溶液中，研磨使花粉破裂，释放精细胞。裂，释放精细胞。优点：不过分依赖花粉成熟度，特

17、别适合于在低渗溶液优点：不过分依赖花粉成熟度，特别适合于在低渗溶液中不易破碎的花粉。中不易破碎的花粉。缺点：花粉壁碎片小，不易清除。缺点：花粉壁碎片小，不易清除。二细胞花粉的精细胞分离二细胞花粉的精细胞分离1、花粉离体培养法：花粉在液体培养基中人工、花粉离体培养法：花粉在液体培养基中人工萌发，待形成精细胞后，用渗透压冲击或研磨萌发，待形成精细胞后，用渗透压冲击或研磨使花粉管破裂。使花粉管破裂。缺点：精细胞形成不同步，分离的精细胞中混杂缺点：精细胞形成不同步，分离的精细胞中混杂尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。2、活体离体法：先将花粉授在柱头上，花粉、活

18、体离体法：先将花粉授在柱头上，花粉萌发并产生精子后，用渗透压冲击法分离。萌发并产生精子后，用渗透压冲击法分离。优点：分离的精细胞纯度高，接近受精前的发育优点：分离的精细胞纯度高，接近受精前的发育状态。状态。3、改进的活体离体法、改进的活体离体法卵细胞的分离卵细胞的分离可先分离胚囊，从中分离卵细胞可先分离胚囊，从中分离卵细胞也可直接从胚珠中分离卵细胞也可直接从胚珠中分离卵细胞周嫦和杨弘远首先建立胚囊分离技术周嫦和杨弘远首先建立胚囊分离技术酶解振荡法。酶解振荡法。生活胚囊的分离方法：胚珠放在酶液中，生活胚囊的分离方法：胚珠放在酶液中，酶液：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、酶液：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、蜗牛酶或崩溃酶。蜗牛酶或崩溃