间接免疫荧光检测PBMC

1、2021/8/61 间间 接接 免免 疫疫 荧荧 光光-检测人外周血单个核细胞检测人外周血单个核细胞武汉大学基础医学院武汉大学基础医学院免疫学教研室免疫学教研室熊熊 洁洁2021/8/62原原 理理 间接免疫荧光法是用荧光素标记间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测以检测Ag或或Ab的一种实验技术。其原理是的一种实验技术。其原理是Ag首先与首先与Ab1结合，然后结合，然后Ab1再与荧光素标记的再与荧光素标记的Ab2结合，结合，形成一个形成一个Ag- Ab1-荧光素标记荧光素标记Ab2的三分子复合的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现荧光。物，在荧光显微镜下呈现荧光。2021/8/63 外周血单个

2、核细胞分离外周血单个核细胞分离 - - 葡蔗糖葡蔗糖- -泛影葡胺密度梯度离心法泛影葡胺密度梯度离心法 原理原理 外周血单个核细胞（外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为左右。利用比重为1.077左左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。密度梯度

3、分布，从而将各种血细胞加以分离。2021/8/64 材料材料 1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为泛影葡胺，比重为1.0770.001g/L） 2、 2台盼蓝染液台盼蓝染液 3、 Hanks液或者液或者RPMI-1640培养基培养基 4、试管、吸管、水平离心机等、试管、吸管、水平离心机等2021/8/65 方法方法 1、无菌采集静脉血、无菌采集静脉血2ml注入盛有注入盛有2ml Hanks液液（含（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。肝素）的试管中，混匀。2、吸取淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加

4、至分层液上，应注稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）意保持两者界面清晰。（关键）3、室温、室温2000rmin离心离心20min。管内可分为四层。管内可分为四层。2021/8/662021/8/674、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有入另一支已含有2-5mlHanks液的离心管中，液的离心管中，混匀。混匀。5、室温下，、室温下，1500rpm离心离心10min。2021/8/686、弃上清，重复洗涤一次。、弃上清，重复洗涤一次。 用完全用完全RPMI-1640 1ml定容，计数细胞，调整细定容，计数

5、细胞，调整细胞浓度。胞浓度。 一般每一般每ml血可分离出血可分离出1-2106个单个核细胞。个单个核细胞。7、细胞活力检查、细胞活力检查 取取1滴细胞悬液加滴细胞悬液加1滴滴2%台盼蓝染液，作湿片高台盼蓝染液，作湿片高倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。一般活性应在细胞染成蓝色。一般活性应在95以上。以上。2021/8/69材材 料料1. Ag PBMC2. Ab1 兔抗人白细胞血清兔抗人白细胞血清 (Ab1)3. Ab2 FITC-抗兔单克隆抗体抗兔单克隆抗体 (Ab2)4. 洗涤液洗涤液5. 荧光显微镜荧光显微镜2021/8/610方方 法法1.制备抗原片制备抗原片: 吸管取吸管取1滴滴PBMC液体（约液体（约10ul）滴加到标本片）滴加到标本片黑色圈圈背面中央黑色圈圈背面中央, 静止静止5-10分钟，待分钟，待PBMC干干燥。燥。 2. 15 ul Ab1 加入玻片上加入玻片上37孵育孵育30 min。 PBS洗洗3次次(3min/次次)。2021/8/6113. 玻片上加玻片上加15 ml 荧光二抗荧光二抗 (Ab2) 湿盒内湿盒内37孵育孵育30 min。PBS洗洗3次次(同上同上,避光操作避光操作)4. 用