实验三(设计性实验)九龙江水大肠菌群的测定

1、九龙江水大肠菌群的测定周涛（闽南师范大学生科院食品科学与工程14级）摘要：本文通过多管发酵法测定水源水大肠菌群数量，初步发酵试验检测水源水存在大肠杆菌菌群，平板分离得到单一菌群群落，复发酵试验通过革兰氏染色确定为大肠菌群阳性结果。关键词：九龙江水、大肠菌群、多管发酵法、初步发酵试验、平板分离、复发酵试验、革兰氏染色、DETERMINATION OF COLIFORM BACTERIA JIULONG RIVER WATER Tao ZhouAbstract: In this paper, multiple tube fermentation method determined by the n

2、umber of coliform source water, preliminary fermentation tests detect the presence of E. coli bacteria source water, flat flora isolated single community, complex fermentation test by Gram stain identified as coliform positive results.Key words: Jiulong River water, coliform, multi-tube fermentation

3、 method, preliminary fermentation tests, flat separated, complex fermentation test, Gram stain,1 材料与方法1.1 基本原理多管发酵法包括初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。1.1.1初步发酵试验(48h ，需2天)发酵管内装有乳糖胆盐蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小导管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产生酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其它细菌如芽孢菌生长的

4、作用。水样接种于发酵管内，37下培养，24h 内小套管中有气泡形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟48h 后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48h 后仍不产气的为阴性结果。1.1.2平板分离（1天，初发酵2天后做此实验，此实验第2天即可做革染） 平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂（EMB agar）,前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸

5、钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群落变成为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可以抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红美蓝染料，在此作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的铜绿色深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24h 内产酸产气（阳性结果）和48h 产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。1.1.3复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h 培养产酸又产气的

6、，最后确定为大肠菌群阳性结果。1.2实验材料和设备：器材：试管、吸头（1ml、5ml）、冰箱、量筒、玻棒、烧杯、PH计、培养皿、水浴锅（箱）、培养箱、试剂瓶、电磁炉、显微镜、锥形瓶、接种环、干燥箱、汉德氏管、高压灭菌器、单道移液器、电子分析天平、培养基：乳糖胆盐蛋白胨、伊红美蓝琼脂（EMB） 1.3操作步骤（一）多管发酵（大肠菌群的测定）1.3.1水样的采集：用高温灭菌过的试剂瓶到九龙江取水，将瓶子连瓶盖一起伸到10-15厘米的深处打开瓶塞，等水满后盖上盖子后从水中取出。运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又流回瓶中，从而增加污染。 1.3.2水样的稀释：将灭菌的三根试管各装9ml的无菌水标

7、上1、2、3各组的记号。充分振荡水样，从中吸取1ml于1号试管中，充分振荡即得1：1 0的稀释液。同理配制1：100及1：1000稀释液。1.3.3水源水的检查 （1）从原水样、1:10、1:100、1：1000的稀释液各吸取1ml于4支经过灭菌的装有10m乳糖胆盐蛋白胨液体培养基中，内倒置一德汉氏小导管。（每吸取一次，吸头都要换一次）。（2）将上述溶液混匀后，于36摄氏度培养24h，24h未产气的继续培养至48h。记录其稀释液的产气管数，进行复发酵试验。（3）平板分离经24h及48h 培养后，将产酸产气的发酵管，分别划线接种于相应稀释梯度标签的伊红美蓝琼脂平板上，再于37下培养18-24h。

8、（4）复发酵试验培养18-24h后，将符合下列特征（产酸产气）的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于乳糖胆盐蛋白胨液体培养基中，37培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数表1：大肠菌群检数表(严重污染水)（革阴性=表中+）接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注10.10.010.001（即G+）<900接种水样量为1.111(1,0.1,0.01,0.001个一份)+900+900+950+1800+1900+2

9、200+2300+2800+9200+-9400+18000+23000+96000+238000+>238000大肠菌群检数表(中度污染水)接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注1010.10.01<90接种水样量为11.11(10,1,0.1,0.01个一份)+90+90+95+180+190+220+230+280+920+940+1800+2300+9600+23800+23800大肠菌群检数表(轻度污染水)接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注1001010.1<9接种水样量为11.11(10,1,0.1,0.01个一份)+9+9+9.5+18+19+22+23

10、+28+92+94+180+230+960+2380+2380附录：1.乳糖胆盐蛋白胨液体培养基（本实验采用合成培养基）乳糖 10g 蛋白胨 20g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL （配制时需加热才能溶解）胆盐 5g蒸馏水 1000mL将上述培养基成分溶解于1000mL蒸馏水中后（不能加热），调pH7.27.4，加入0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，充分混匀，分装于置有德汉氏导管的试管内。115灭菌15min。1.4 革兰氏染色法1.4.1基本原理：革兰氏染色法(Gram's staining method)是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医

11、师Gram创立。 革兰氏染色法不仅用来观察细菌的形态，而且它还是细菌鉴定的重要方法，可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂-碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌G+，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌G-。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无

12、芽胞杆菌都呈现负反应。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。1.4.2器材：1.菌种 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物，蜡样芽孢杆菌（B.cereus)1224h营养琼脂斜面

13、培养物。2.染色剂：革兰氏染色液。3.仪器及其他用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸、生理盐水等。14.3操作步骤：1.4.3.1制片（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中间加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，制成很薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）注意：要用活跃生产期的幼培养物做革兰氏染色；涂片用的载玻片要洁净无油污迹，否则影响涂片。挑菌量应少些，涂片宜薄，过厚重叠的菌体则不易观察清楚。1.4.3.2 初染（1）结晶紫色染色：将玻片置于干净的

14、培养皿上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1-2分钟。（2）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。1.4.3.3媒染（1）用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟。（2）水洗：用水洗去碘液。1.4.3.4脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性细菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性细菌。而脱色时间过短，革兰氏阴性细菌则会被误认为是革兰氏阳性细菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄、脱色时玻片晃动的程度等因素的影响。脱色时间一般约20-30s。1.4.3.5复染（1）用番红

15、复染约2分钟。（2）水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。（3）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。1.4.3.6镜检镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。2 总结与讨论注意事项:1、在初步发酵试验中，德汉室小导管倒置时，应先使液体斜面倾斜，再迅速把小导管倒入试管内，如果动作缓慢，则进入试管内的小导管会有气泡，影响实验结果判断。2、在平板分离试验中，手拿培养皿时注意靠近酒精灯，对接种环进行杀菌，否则，容易引入杂菌。3、革兰氏染色中，注意初染、媒染、酒精脱色、复染的步骤顺序，每一次染色都要用水冲洗至水流没有颜色为止，每次染色都要保证染色时间12分钟。4、显微镜观察时，注意规范使用。问题与思考（1） 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？答：制备适宜的培养