实时荧光定量PCR实验结果分析

1、u定量分析绝对定量相对定量u定性分析SNP分析，基因扫描阴阳性判定熔解曲线分析绝对定量：How Many优点：给出目标基因初始模板的绝对数量，数据容易处理缺点：必须有标准品，做标准曲线应用：病毒拷贝数；转基因的拷贝数；转基因成分百分含量检测相对定量:How Much 优点：需要/不需要标准品；使用广泛缺点：数据理解困难应用：差异表达分析；芯片评估14500 copies108106102104108106102104T108106102104T10105 5 copies/well copies/well1/3Blank1/31/31/31.11 ng/2ul0.37 ng/2ul0.12 n

2、g/2ul10.0 ng/2ul3.33 ng/2ulTControl CT = 21.3Sample A CT = 22.8Sample B CT = 19.3 Control CT = 21.3 = 1.5ng / tube 1Sample A CT = 22.8 = 0.5ng / tube 0.33Sample B CT = 19.3 = 6.0ng / tube 4Fold管家基因校准(Normalization Gene)得出每个细胞中的目的基因目标基因vs. 管家基因对照样品校准(Calibrator Sample)得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample.处理的vs

3、. 未处理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常.目标基因管家基因处理后处理前ERBB2GAPDHSampleCalibrator按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度至少需要两个标准曲线GOIreference gene标准曲线确定反应扩增效率依据：平均相对含量% = 2 平均CT数据处理： C（t）GOI- C（t）ref= C（t） C（t）sample- C（t）calibrator= C（t）好处：不做标准曲线应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估）；不要求很高的精度RNA提取RT-qPCR实验

4、结果分析RNA定量反转录(RT)设计qPCR实验方法Aurum Total RNA kitiScript cDNA Synthesis Kit已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针标准品（质粒）构造标准曲线多重PCR反应阴性对照 无RNA对照（空白） 无逆转录酶对照（监控基因组污染）Experion RNA StdSens Chip5-500 ng/ml100-6,000 ntExperion RNA HighSens Chip0.1-5 ng/ml100-6,000 nt乳癌

5、组织 RNA正常乳腺组织 RNA5 hr. at 90CIntactIntact7 hr. at 90CIntact7 hr. degradationGAPDH geneIntact5 hr. degradation在不同的反应管中运行RT & PCR1. 反转录反应 加热灭活反转酶2. PCR 反应2. PCR 反应1.反转录反应1. 25C 5 min2. 42C 30 min3. 85C 5 min 4. 冷却至4C iScript cDNA Synthesis Kit1. 定性条件摸索2. 荧光化学物质SYBR GREEN染料Taqman探针3. 定量PCR条件优化4. 单双通

6、道相互验证qFam标记目标基因探针qVIC标记看家基因探针动态温度梯度动态温度梯度5-6oC Below10oC Above预设退火温度预设退火温度Real annealing range 95C,15min94C,15sec60C,1minplate readgo to step 3,39 more times10C,foreverEnd 目标基因： 未知样品 生成标准曲线： 标准品梯度 监控系统故障： 阳性对照 监控污染： 阴性对照/基因组对照 校准生物学误差：看家基因 降低其余误差： 重复实验Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM det

7、ection for ERBB2ERBB2单双通道相互验证的实验结果A.Multiplex ReactionsHealthy RNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65 0.1526.80 0.32B.Singleplex reactionsHealthy RNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70 0.0326.82 0.24样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAM detection- ERBB2PMT2-VIC detection- GAPDH肿瘤肿瘤正常HealthyRNATumorR

8、NAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copies ng/ l Total RNAERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.0197Healthy RNATumor RNA0.0110.0180.018/ 0.0111.63HealthyTissueCarc.TissueRelative Expression00.20.40.60.811.21.41.61.82C(t)=4.41-5.18=-0.770.182-c(t) =1.511.93结果与双标准曲线法相近结果与双标准曲线法相近Healthy RNABBER2GAPDHC(t)28.4023.2