以生物大分子互作为基础的基因克隆方法

1、蓝色海洋书的海洋以生物大分子互作为基础的基因克隆方法 1酵母双杂交体系 酵母双杂交体系主要用于讨论蛋白质之间的互相作用。该体系用于分析已知蛋白质之间的互相作用，或者是用于筛选与已知蛋白质互相作用的未知蛋白质分子。酵母双杂交系统的可行性和有用性经过多年的用法已经非常完美。酵母双杂交的基本原理：真核细胞的转录激活作用是由功能相对自立的dna结合结构域(dna binding domain, bd)和转录活化结构域(transcription activation domain, ad)共同完成的。这两个结构域通过共价或者非共价衔接建立的空间联系是导致蛋白质之间互相结合和转录激活的关键。利用这个特点

2、，我们就可以举行蛋白质互相作用之间的分析。假定两个不同的蛋白质分子x和y，它们之间存在互相作用。那么，我们可以将x和y分离与酵母转录因子的两个结构域结合形成融合蛋白质，也就是bd-x/ad-y或者bd-y/ad -x。当这两个蛋白质结构域(bd-x/ad-y)单独存在时无转录激活功能。而当两个不同的蛋白质分子x和y之间存在互相作用、bd/ad两个结构域逼近或者共价结合时转录功能复原。在通常的状况下，已知的蛋白质x与dna结合结构域互相融合形成bd-x融合蛋白，而待检测的蛋白质y与转录活化结构域互相融合形成ad-y, x-bd融合蛋白称为诱饵蛋白(bait protein)，而y-ad融合蛋白称

3、为被诱捕蛋白(prey protein)。含有x, y的蛋白质同时在一个中表达，当x与y之间能够发生互相作用时，诱饵蛋白和被诱捕蛋白之间能够在空间上互相逼近，报告基因得以激活。相反，假如x与y之间没有互相作用，诱饵蛋白和被诱捕蛋白质之间就不能够在空间上互相逼近，报告基因不表达。按照这个原理可以便利地检测蛋白质之间的互相作用。酵母双杂交系统充分利用了酵母能够表达真核生物基因，不需要分别纯化蛋白质，囫囵过程只需要对举行操作，同时酵母的生长速度快、简单操作等优点，使酵母双杂交系统的应用非常广泛。常用的酵母双杂交体系包括以gal4为基础的体系和以lexa为基础的双杂交体系(图8-10)。图8-10酵母

4、双杂交暗示图a转录激活暗示图；b.酵母双杂交暗示图。ad表示转录激活位点；bd表示dna结合位点；reporter gene为报告基因酵母双杂交系统用法的基本步骤如下所述。(1)鉴别已知蛋白质之间是否存在互相作用。鉴定两个已知蛋白质之间是否存在互相作用是酵母双杂交系统最为有效的办法。只需要将两个待讨论的蛋白质分离与ad和bd互相融合，同时转化同一个，通过检测报告基因是否表达来判定x与y之间是否存在互相作用。图8-11为如何检测两个蛋白质之间是否存在互相作用的流程图。图8-11鉴别已知蛋白质之间有无互相作用的流程图(2)寻觅与某个蛋白质互相作用的未知蛋白质。讨论蛋白质之间的互相作用可以鉴定出与已

5、知蛋白质发生作用的新的蛋白质分子。寻觅与目的蛋白质互相作用的蛋白质时，首先构建含有目的蛋白质基因的表达质粒(bd-x)，鉴定bd表达质粒的自转录活性。假如蛋白质x没有自转录活性，那么bd-x就可以用于酵母双杂交的筛选。然后，将待分析的cdna克隆到ad表达质粒中构建酵母双杂交的cdna文库(ad-cdna)，将表达的质粒和杂交的文库共同转化，获得表达的阳性克隆。抽提ad表达质粒并对阳性质粒的插入片段举行测序。测序完成以后，逐一分析所得到的候选蛋白与y蛋白之间作用的真切性。假如的确存在互相作用，那么就可以初步认定两个蛋白质之间为互作蛋白。结合分子生物学和遗传学的手段，我们可以最后找到蛋白质x的互

6、作蛋白。这个分析过程8-12所示。2噬菌体展示技术噬菌体展示技术是g. p. smith等于1985年提出来的一种利用蛋白质互相作用的体外免疫系统，它能够将基因片段与蛋白质分子有效地联系在一起。噬菌体展示技术的基本原理是，当外源dna片段分子插入到丝状噬菌体基因组中的一个外被蛋白质基因中时，假如两者的读码框架保持全都时，外源片段的dna分子所编码的产物可以与外包被蛋白质一起形成一个融合蛋白质，这个融合蛋白质可以显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物的抗体，通过抗原一抗体的亲和作用，就能够从大量噬菌体中分别出含有所要基因的融合噬菌体。然后，通过基因扩增就可以得到大量所要的目的基因片段。图8

7、-12寻觅与某个已知蛋白质互相作用的蛋白质噬菌体展示技术的基本过程如下所述。(1)构建噬菌体抗体库。构建一个大容量的噬菌体库是噬菌体展示技术的关键所在。通常用于构建噬菌体抗体库的噬菌体包括两种不同的类型。一种是以m13, fl, fd等为载体的抗体库；另一种是以上述噬菌体的复制起始序列为基础组建的噬菌体质粒载体(phagemid)。丝状噬菌体的外被蛋白基因班和基因珊是常用的与外源dna序列一起产生融合蛋白的基因。基因编码由406个氨基酸组成的p3蛋白，每个噬菌体由35个不同p3蛋白组成，位于丝状噬菌体的一端。基因编码50个组成的p8蛋白，每个噬菌体上大约有2700个p8蛋白质分子。这两种不同蛋

8、白质的共同点是蛋白质的n端位于噬菌体的外部，而c端位于噬菌体的内部。当外源dna片段与这两个基因互相融合时蛋白质的片段裸露在噬菌体的表面。对实际用法而言，讨论者更偏向用法噬菌体质粒载体作为构建抗体库的载体，因为噬菌体质粒载体既有质粒的复制起点又有噬菌体的复制起点，非常简单操作并且转化效率比较高。抗体库的构建：首先利用限制性内切将噬菌体质粒载体酶切，然后与待分析组织的cdna分子举行衔接，衔接以后的dna分子挺直转化大肠杆菌宿主细胞，转化以后的大肠杆菌在协助噬菌体(helper phage)的作用下，噬菌体质粒被包装，然后通过噬菌体的获救办法构建成为噬菌体抗体库。一个比较典型的噬菌体抗体库的容量

9、通常在109个以上。随着抗体库容量的增强，筛选到特异性抗体片段的可能性就越大。(2)从噬菌体库中筛选特异抗体。噬菌体抗体库构建完成以后，下一步的工作就是从抗体库中筛选特异的抗体。抗体筛选的基本原则是亲和捕捉。首先将抗原包被在固相物质的表面，如384孔的微孔板上，然后加入噬菌体抗体库与抗原举行温育。温育一段时光以后，将微孔板放入缓冲液中举行淘洗。经过淘洗以后，表面留下那些能够与目标抗原相结合的抗体噬菌体。亲和捕捉办法的筛选效率高，特异性比较强，能够从109个以上克隆的抗体库中筛选获得一个特异性的目的基因。(3)阳性抗体克隆的dna序列分析。因为经过一次亲和捕捉的噬菌体有多个，因此亲和捕捉以后的噬菌体举行繁殖，再次感染。这些再次感染的大肠杆菌又可以形成一个小型的富集的噬菌体抗体库。这个小型的噬菌体抗体库再次重复以上的筛选过程直到获得少量的克隆为止。(4) dna序列的分析和验证。将这些有高度亲和能力的噬菌体举行回收。通过质粒获救的办法就能够将外源的片段分别出来。通过测序就能够获得基因的所有序列。(5)基因功能的鉴定。通过突变缺失办法进一步分析基因功能。除了上述的一些基因克隆办法以外，随着基因组技术的进展，利用生物信息学手段来协助和寻觅新的基因是一种重要手段。因为越来越多基因组的全序列被测定，随着功能基因组讨论和后功能基因组讨论时代的到来，基因克隆与分别在技术上已经不存在大的障碍。普通