影响PCR的主要因素

1、影响PCR的主要因素PCF术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR金测试剂盒就可开展工作,PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA羊品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参疝云一致。现将几种主要影响因素介绍如下。一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94C60s, 37C60s, 72C 120s，共2530个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所 要求的

2、温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要3060s,这一退滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间的温度差， 在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前 文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。1.模板变性温度变性温度是决定PC版应中双链DNAB链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA莫板，PC趾就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNAa链

3、会很快复性，因而减少产量。一般取9095Co样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNAe性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95C。2.引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37 C反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的(G+C炳量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing

4、temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5C,可按公式进行计算：Ta = Tm - 5 C = 4(G+C)+ 2(A+T)- 5 C其中A, T, G C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果(G+C %念量为50%时，贝U Ta的起点可设在55C。在典型的引物浓度时(如0.2 mol/L )，退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。3.引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取7075C ,在72 C时酶催化核昔酸的标准速率可达35100个核昔酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液

5、的组成、pH值、盐浓度与DNA莫板的性质。扩增片段如短于150bp,则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100300bp之间的短序列片段， 采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的DN喝段，可根据片段长度将延伸时间控制在17min,与此同时，在PCR冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DN麻合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15吩20%勺甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA段。4.循环次数常规PC般为2540个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。 当

6、然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。扩增结束后，样品冷却并置4C保存。二、引物引物设计要扩增模板DNA首先要设计两条寡核昔酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DN昕列互补的寡核背酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置。由此可见，引物是决定PCFT增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为1520个碱基，可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此之外，引物设计一般遵循的原则包 括：1

7、.引物长度根据统计学计算， 长约17个碱基的寡核昔酸序列在人的 基因组中可能出现的机率的为1次。因此, 引物长度一般最低不少于16个核昔酸，而最高不超过30个核昔酸，最佳长度为2024个核昔酸。这样短的寡核 昔酸在聚合反应温度(通过72C)下不会形成稳定的杂合体。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性 酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等 各种目的。有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。2.(G+C%念量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C %量应尽量相似，在已知扩增片段(G+C垢量时宜接

8、近于待扩增片段，一般以40% 60溶佳。3.引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构(hairpin structures)。例如：4.引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成引物二聚体”或引物二倍体(Primer dimer)。所谓引物二聚体实质上是在DN麻合 酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PC见的副产品，有时甚至成为主要产物。另外，两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核昔酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待

9、扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。5.引物3端配对DN成合酶是在引物3端添加单核昔酸， 所以，引物3端56个碱基与靶DNA勺配对要 求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。引物设计是否合理可用PCRDES嗽件和美国PRIME啾件进行计算机检索来核定。人工合成的寡核昔酸引于最好经过 此(层析)纯化或PAGE屯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯 化引物在25宜睛溶液中4C保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的引物应保存在-20C冰箱中，在液体中引物能保存6个月，冻干后可保存12年。三、D

10、N麻合酶早在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶，并且得到了DN成合酶I纯品。DNA合酶I是由分子量为109000的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为76000,有聚合酶活性，并有3 5外切酶活力，即Klenow片段(Klenow fragment )。另一个片段分子量为34000,具有5 ： 3外切酶活力。因此，DN成合酶具有几种功能：一是聚合作用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核昔酸逐个加到3-OH末端。二是有35，外切酶活力，能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。三是53外切酶活力，它能从5端水解核昔

11、酸，还能经过几个核昔酸起作用，切除错配的核昔酸。1985年Mullis等发明了PCR方法，以Klenow片段完成3-珠蛋白的PCR，世界上许多实验室就考虑用耐热DN麻合酶代替Klenow片段进行PCR使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生活于60C（B.Stearothermophilus）到87C（S.Solfatavicus ）的许多菌中分离纯化出耐热DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA变性所需温度，所以无法应用于PCR现就PCR反应中常用的DNAM合酶等作一详细介绍。1.Taq DN麻合酶用Taq DNAM合酶代替大肠杆菌DN麻合酶I的Klenow片段是使PC丽及应用的关键。Kleno

12、w片段不能耐受95C的双链DN/性温度，所以每次循环都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受9395C的高 温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和DNAT级结构对PCR勺干扰，增进了PCR特异性、产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：Klenow酶的最适温度为37C,扩 增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为7475Co因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow酶为20个 （均用1 g基因组DNA开始） 而T

13、aq酶为30个。 延伸片段长度Taq酶为10kb以内， 而Klenow酶为400bp以内。Taq酶由水栖高温菌（Thermus aquatics ） YT1跷株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园 温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为7075C。最初从中分离到分子量6068KDa比活性为20008000U/mg的DNA聚合酶。后来Cetus公司的Kary Mullis等又分离到比活为20万U/mg的纯酶，分子量为93910。此种9.4KDa酶的最适温度为7580C，与单纯核昔酸的结合率（Kcat ）可达150核昔酸（nt）/s酶分子。以M3模板，用富含G+C的30b

14、p引物延伸，70C时Kact60nt/s ; 55C可达24nt/s ; 37C时为1.5nt/s，而22C时低至0.25nt/s。高于90C时DN成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。在PCR应混合液中，Taq酶于92.5 C,95 C及97.5C保持其50嘛力的时间分别为130、40及56min ,在50次循环的PCR中当管内最高温度为95C。每循环为20s时尚可保持65购力。Taq酶在95C的半寿期为40min ,故在PCRB环中选用的变性温度，不宜高于95CoTaq酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为Ampli Taq （Cetus公司）。Taq酶的完整基因长2499

15、bp,在大肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌DN成合酶I有38泌一致的，包括对dNTP结合，引物与模板作用区均存在于Taq酶中。Taq酶具有依赖DNA合成的53外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3-磷酸化的“阻断物”， 会被逐个切除而不会阻止来自上游引物链的延伸，而对于5 -32P标记的合成寡核昔酸引物，则无论是单链或是与模板复性，都未发现降解，所以该种活性不会影响PCR吉果。Taq酶没有35外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR产物中点突变较多，对克隆等不太有利。一般错掺率为1.25 X 10-41X 10-5（4 X

16、dNTPs浓度分别为200 mol/L , M&+为1.5mmol/L ,在55C退火）。但不含35外切酶活性对测序有利。2.影响酶活力的因素Taq酶的活力受M&+离子的影响。用鲜精DN网模板，总dNTP浓度0.70.8mmol/L,Mg2+ 为2.0mmol/L时激活能力最高。 浓度超过此值产生抑制。10mmol/l MgCb抑制活力达40% 50% dNTP能与M&+结合， 故游离Mc2+只是结合后剩余的量。若总dNTP度高至46mmol/L时,Taq酶活力要降低2030%即底物抑制。dNTP度低时PCRT率及特异性均增高， 适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素

17、。当100 l PCR夜中含dNTP各40 mol/L时就足以合成2.6 g的DNA（ dNTP消耗一半）。表22-3有机溶剂对Taq聚合酶活力的影响物质浓度活力（%）乙醇3%10010%110尿素0.5mol/L1001.0mol/L1181.5mol/L107DMSO1%10010%15320%11二甲基甲酰胺5%10010%8220%17甲酰胺10%10015%8620%39SDS0.001%1050.01%100.1%0.1%用鲜精DNA 70C, 10min内dNTP的掺入量计算，标准条件为100%纯9.4KDa Taq酶不含35核酸外切酶活力。误掺入率取决于dNTP度。但Taq酶具

18、有DNAa赖的链移位53核酸外切酶活力。对53，32P标记寡核昔酸单链，或与MB莫板杂交时均只有极少的降解力。中等浓度KCl能刺激Taq酶合成活力达50%H60%最佳KCl浓度为50mmol/L,浓度更高有抑制作用，200mmol/L的KCl可使酶失活。加入50mmol/L NH4Cl或NHAc或NaCl，可产生中度抑制或无作用。低浓度尿素、DMSODM诚甲酰胺影响不大，吐温20/NP40可消除SDS (0.01%及0.1%)的抑制作用。3.第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel将Taq DNA聚合酶的53外切酶活性片段(N端289个氨基酸)去除，称为stof

19、fel片段。其97.5 C的半衰期从Taq DN成合酶的56min提高到20min,同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合PCR( Multiplex PCR)更为有利。VentTMDN彩聚酶：是美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔(Vent)中分离的超级嗜热菌-能生长于98C中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。它的一些酶学性质较Taq DNA聚合酶更为优越，它能耐100C高温且2h以上仍有活力，并且具有3 5外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比Taq酶降低一倍。后来该公司又从深水潜艇(2010g排气孔分离的能

20、在104C生长的Pyococcus菌GB-D株植入DeepVent DN成合酶基因而表达的Deep Vent DNA聚合酶，在95C的半寿期达23h (Vent酶为6.7h,Taq酶为1h)。4.RTth逆转录酶(rTth Reverse Transcriptase)目前逆转录-PCR (RT-PCR的发展很快，所以对耐热的依赖于RNA的DNA多聚酶的研究也有进展。有实验表明Taq DNA多聚酶有依赖于RNA的DN成合酶活性，但活性较弱。Cetus公司于1991年推出一种rTth Reverse Tran scriptase,有很好的依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖 于DNA的耐热DN

21、A聚合酶活性，二种活性分别依赖于Mn+M&+,这样就可分别控制酶活性。利用该酶只需250ng的总RNA可有效地进行RT-PCFR得到特异的DNA片段，从而非常有利于逆转录PCR的发展。耐热DN成合酶的研究近几年来得到长足的发展，这在PCRt展中起到了重要的作用。我们相信随着进一步的研究，将使人们对耐热DNA聚合酶的认识和应用更进一步地发展。我国的PCR研究发展很快，其关键试剂 -耐热DN腺合酶-也已有几个实验室能够分离纯化，如复旦大学遗传学 研究所、华美公司、中国医学科学院基础医学研究所。后二者的菌株为Thermus aquaticus YT-1。前者则是从自己筛选的嗜热菌中分离纯化，

22、复旦大学遗传所亦已成功地克隆了该聚合酶的基因并获得了耐热F4DNA聚合酶，其酶学性质非常接近于Taq DNA聚合酶，为我国PCR的开展提供了保证。四、 影响PCR特异性的因素通过上述内容。可以看出有许多因素可以影响PCR的特异性，在此我们作一归纳，供大家参考：退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及 错误延伸。引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。 改变MgCb(有时KCl)浓度可以改进特异性， 这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR昆合物中的4X dNTPs中加入7-脱氮-2-脱氧鸟昔-5-三磷酸(7-deaza- 2 -deoxyguanosine- 5 -trihosph