禾本科植物中的R

1、 杨月禾本科植物中的R基因对稻瘟病的抗病性作者介绍作者介绍： 杨四海、李静、张晓辉、黄菊、陈建群、田大成是南京大学生命科学学院生物技术制药国家重点实验室成员，这几年都致力于研究水稻病因及抗性基因。 张奇骏，来自南京农业科学院。 Daniel L. Hartl，来自剑桥哈弗大学生物进化系。PNAS: 美国科学院院报，是被引用最多的综合学科文献之一。是美国科学院的院刊，也是世界上公认的四大名刊之一。自1914年创刊至今，PNAS提供具有高水平的前沿研究报告、学术评论以及美国国家科学学会学术动态的报导和出版。文献涵盖生物、物理和社会科学。 在SCI综合学科类排名第三位。2011年影响因子为9.681

2、。在SCIE所有期刊中，特征因子位列世界第二。摘要：摘要： 当把玉米、高粱、短柄草基因组中的某些基因导入水稻中，就会产生对稻瘟病的抗病性。这些基因就是所谓的抗性基因（抗性基因（R基因），基因），能够编码核苷酸结合位点及富含亮核苷酸结合位点及富含亮氨酸重复序列氨酸重复序列。随后，在水稻和这些植物中发现了三种快速进化的三种快速进化的R基因家族基因家族。在这些基因中，随机选取一些导入到对由稻瘟病菌引起的稻瘟病敏感的水稻株系中。用这些植株对12种不同的稻瘟病菌进行敏感性或抗性试验。总体上看，从玉米、水稻、短柄草中克隆的60个核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列（NBS-LRR）发现了有15种功能性的抗稻

3、瘟病R基因。其中13种在水稻的20个NBS-LRR间接同源物上获得。这些结果表明对快速进化的病原菌产生了抗性。传统进化的保守性和传统进化的趋同性均不能对我们的发现提供一个满意的解释。于是，我们提出了一个独特的机制叫“受限分受限分歧歧”：R基因和病原菌效应器可以遵循有限的进化途径来提高适应性。我们的结果提供了对R基因鉴定的途径，将有助于阐明R基因和效应器的相互作用机制，会产生之久的病原体抗性。 稻瘟病是由稻瘟病菌引起的，稻瘟病菌是水稻中的毁灭性的病原菌，它可以传染其他的像大麦、小麦等重要的作物。这种病原菌进化快速，显示出大量的物种特异性。 植物中有几种防御病原菌的屏障： 第一道屏障：含细胞壁、蜡

4、质层在内的固有的结构屏障。 第二道屏障：跨膜的病原体相关的分子模式识别受体的主 动应 答，抵抗进化较慢的许多病原共有的蛋白质结构域。 第三道屏障：针对特异的病原菌种类。在这个过程中， 病原体效应器激活宿主的R基因。NBS-LRR 基基因因NBS位点位点：包含了一些能结合并水解ATP、GTP的保守的结构域。LRR结构域结构域：NBS-LRR基因识别外来蛋白并参与蛋白质-蛋白质的相互作用的位点，决定了基因抗病特异性。这样的NBS-LRR基因在识别和抵抗来自昆虫类或线虫类的病毒、细菌、真菌的不同的病原体起着重要作用。 R基因主要类群编码包括NBS-LRR在内的基因。 拟南芥有约150个NBS-LRR

5、基因，在水稻中超过400个.R基因扩增涉及串联重复和片段重复，因此这些基因易形成基因簇基因簇。 有些基因显示出快速进化的典型特征有些基因显示出快速进化的典型特征：多种多样的拷贝数目，在系统进化树上有较短的分支。值得注意的是，同一基因组内不同的同源物之间有较低的差异；较高的Ka/Ks（非同义替换/同义替换）比率以及物种内高水平的多态性。推论推论： 在一些植物的物种中的快速进化的R基因家族可能包含对一种病原菌效应器产生抗性的等位基因，会影响相关的物种。重要性重要性： 我们发现，在玉米、高粱、短柄草、水稻中的一些快速进化的植物抗性基因，会对一种水稻基因中的一种或多种稻瘟病菌产生抗性。这些结果表明，快

6、速进化的R基因和病原菌侵染效应只能通过有限的进化途径来提高适应性，这种进化的机制，我们叫做“受限差异”。分子系统发生学会提供一种提供一种R基因鉴定的基因鉴定的有效的途径和代替图为克隆的一些方法。有效的途径和代替图为克隆的一些方法。 为了验证这种预测，我们描述了在玉米、高粱、短柄草中R基因家族编码的NBS-LRR基因的特征，证明了这些R基因进行快速的进化。我们克隆了一些这样的基因，把它们导入侵染了稻瘟病的水稻株系中。发现25%的克隆基因会对12种稻瘟病菌中至少一种产生抗性。这些结果证实了，不仅在种内，也会出现在种间，R基因编码的NBS-LRR基因也会进行快速地进化。 结果结果 ： 鉴鉴定亲缘关系

7、较远的相关物种中的快速进化的定亲缘关系较远的相关物种中的快速进化的NBS-LRR基因基因家家族族 为了验证候选R基因克隆的基因家族的快速进化。按照最大似然法建立基因树建立基因树。16个大的基因家族的数目已经被鉴定在基因树上，是根据以下的标准建立的：平平均每个物种的四个以上的拷贝基因；两个或以上新复制出的间接同源物（核苷酸均每个物种的四个以上的拷贝基因；两个或以上新复制出的间接同源物（核苷酸差异差异5% ）;距离基因树的根部较近的分支并有很高的繁殖能力（距离基因树的根部较近的分支并有很高的繁殖能力（70%），），这些就是快速进化的基因家族的特征。 计算16个大的基因家族中的，横向同源物的数目都与

8、同一基因组中其他同横向同源物的数目都与同一基因组中其他同源源物物的的差差异异（5%），每个物种的平均拷贝数目以及每个物种的平均拷贝数目以及Ka/Ks的比率的比率。系统发育树系统发育树：描述这一群有机体发生或进化的拓扑结构基因树基因树：当一个分子系统树是根据某一个基因数据构建而来的物种树物种树：代表一组物种进化过程的系统树Rp1/Pi37亚科的基因树亚科的基因树Rp3/Pi亚科的基因亚科的基因树树AC134922亚科的基因树亚科的基因树在这三个家族中克隆筛选抗稻瘟病的在这三个家族中克隆筛选抗稻瘟病的R基因基因根据水稻转化的方便以及这些基因家族的鉴定，我们开始进行了以下试验：（1）不管这些Rp1/

9、Pi37基因家族的同源物基因是来自玉米、高粱还是短柄草都可以产生对稻瘟病的抗病性。（2）不管水稻中Rp3/Pc基因家族（包括R基因）的那个同源物，都可以抵抗稻瘟病。（3）不管快速进化的AC134922基因家族中的哪个基因（包括R基因）均可抗稻瘟病。 为了进行这些试验，克隆了一些从Rp1/Pi37、Rp3/Pc、AC134922基因家族得到的启动子和终止子，并将它们导入到水稻中，所有的克隆基因都被排好序列并注释。根据六个非病原性基因的高水平的核苷酸差异、它们的地理分布以及产生大量孢子的能力。遍布中国，从85个株系中分离出的12种稻瘟病菌。由12株稻瘟病株系的每一株产生孢子，长成的水稻转基因株系。

10、根据他们对稻瘟病菌的敏感性/抗病性进行分类。 重复的实验和转化株的筛选表明所有挑选的物种中的许多基因都不断地对挑选的物种中的许多基因都不断地对稻瘟病产生抗性。稻瘟病产生抗性。 我们发现R基因的抗性很少是由于转基因的反常的转基因的反常的过过表达表达。为了验证这个可能性 。对Rp1/Pi37基因家族的一个基因进行检测，测量它们基因的表达水平。将从玉米和高粱中克隆的Rp1/Pi37基因家族的2个基因导入水稻易感植株中，发现转基因NBS-LRR基因的表达水平，分别比他们内生性控制低37.5和47.1倍，表明基因并没有高表达。另外Rp1/Pi37基因家族GM2到Shin2基因的种内转化株显示出表达水平上

11、没有明显的差别。在病原菌接种48h后，转基因个体中的这三种基因的表达水平分别比没有病原菌接种的转基因植物相对增加17.2倍、10.4倍、7.4倍。这些实验中基因的表达水平与以前报告中的数据相似。讨论讨论 用传统的标准评定分子进化的速率，证实了在玉米、高粱、短柄草中编码的NBS-LRR基因的三种快速进化的R基因。这些基因家族中的每个基因都被导入到水稻易感株系中，测定转化株对由12种不同的稻瘟病菌引起的稻瘟病产生抗性。我们又检测了水稻基因组中这些相应的R基因家族的成员，其中有20种R基因至少对一种稻瘟病植株产生抗性有关。其中13种可以至少对1种病原体植株产生抗性，测量在一个抗性转化株中的一些基因的

12、表达，表明R基因对稻瘟病的抗性与转化基因的过表达无关。“保守性保守性”“”“趋向性趋向性”“”“受限差异受限差异” 抗稻瘟病的种间交叉的R基因的进化分子机制仍然在研究。有一个种间交叉抗性的先例。其中一个例子，玉米的一个NBS-LRR基因，RX01，对玉米细菌条纹叶枯病以及水稻细菌条纹病产生了抗性，而RX01基因并不显示出快速进化的特征以及水稻的这种病原菌进化慢的特点。这与我们所描述的R基因家族以及水稻稻瘟病菌的快速进化有分歧。 古典的趋同进化论为我们的发现提供了一种可能机制，病原菌的效应器引起玉米、高粱、短柄草的R基因的应答时相同的。相反，效应器似乎发生了重要的分子变异，转录特异性的R基因只会

13、对一些特殊的稻瘟病菌株产生抗性，与个别的R基因不同。这种在稻瘟病中的抗性变异反对常规的趋同进化论，支持类似于趋同进化的过程，但分子机制不同。我们根据发现建立了一个模型模型： 在抗菌的过程中，抗生素的目标蛋白会限制向更适应进化的途径。如果这也是由于快速进化的R基因的话，猜想这种病原菌效应器进化的途径是相互融合或这种病原菌效应器进化的途径是相互融合或缠绕的，这些相应的缠绕的，这些相应的R基因的进化途径也将是如此。基因的进化途径也将是如此。这样，在相关病原菌中快速进化的效应器与它们相互作用的R基因会出现一种进化的现象。快速进化的NBS-LRR基因显著地进行正向选择，基因的转换频率高，易发生重组、转换

14、、不等交换等，都会产生大量的序列差异，从而有利于应对进化较快的病原菌。 R基因基因抵抵抗快速进化的病原菌的唯一来源抗快速进化的病原菌的唯一来源 这项研究中大量的已鉴定的抗稻瘟病的R基因证实了鉴定新的证实了鉴定新的R基因就是根据基因就是根据进化的分析在基因家族的同源物中仔细挑选出来的进化的分析在基因家族的同源物中仔细挑选出来的。这个方法比图位克隆法以及其他常用的方法更有效。先前使用其他方法鉴定出来的不同的抗稻瘟病R基因的数量是28. 实验中鉴定R基因的高效率，支持在快速进化的基因家族中的快速进化的基因家族中的NBS-LRR基因基因很有可能产生对快速进化的病原菌的抗性。很有可能产生对快速进化的病原

15、菌的抗性。来自同一祖先的NBS-LRR基因在物种间保持一种相似的功能。这28种鉴定出来的抗稻瘟病的R基因（15种来自玉米、高粱、短柄草，13种来自水稻）分布在这三种家族中：17种来自Rp1/Pi37家族，5种来自Rp3/Pc基因家族，6种来自AC134922基因家族，一些拓扑学研究表明很有可能在物种形成之前，它们来自同一祖先。这种这种R基因的鉴定方法，在研究基基因的鉴定方法，在研究基因和与病原菌效应器的相互作用方面提供了新的方法。因和与病原菌效应器的相互作用方面提供了新的方法。材料与方法材料与方法 植物材料及稻瘟病来源 抗稻瘟病试验 基因表达试验 系统发生分析 植物的材料植物的材料： 这些使用

16、的种子有不同的来源。染色体的这些使用的种子有不同的来源。染色体的DNA是通过是通过CTAB法从新鲜的叶子中提取的。根据它们的基因组设计引法从新鲜的叶子中提取的。根据它们的基因组设计引物物。 长的长的PCR产物被注入到双运载体产物被注入到双运载体PCAMBIAI3000中中单单基因拷贝基因拷贝农杆菌转化农杆菌转化得转基因株系得转基因株系用来繁殖得到足够用来繁殖得到足够多的种子多的种子。3个个星星期期后后10棵转基因株系幼苗棵转基因株系幼苗+2棵棵R基因的幼苗基因的幼苗+2棵易感的（无效棵易感的（无效R基因载体）的基因载体）的幼苗幼苗喷洒稻瘟病菌的孢子混悬剂（湿润、喷洒稻瘟病菌的孢子混悬剂（湿润、26恒温箱、黑