PCR及反应条件的优化

1、1. 目的 DNA片段 质粒 TA载体5.连接 重组质粒目的 DNA6. 转化无质粒的E.Coli 死亡有质粒的E.Coli 存活含抗生素培养基中生长2. PCR 2-3min平板筛选实验课安排质粒提取7.酶切实验报告要求1.1. 最后最后2 2学时进行实验课考试学时进行实验课考试(20(20分分) )2.2. 开卷开卷, , 但不许抄袭其它同学试卷。但不许抄袭其它同学试卷。3.3. 内容为两个实验：内容为两个实验： 实验目的、主要步骤（简答）、（实验目的、主要步骤（简答）、（3 3分）分） 结果（画图）、结果分析、结果（画图）、结果分析、 （4 4分）分） 有关实验的问答题（注意听讲）（有关

2、实验的问答题（注意听讲）（3 3分）分） 4. 4. 收卷时签名。收卷时签名。实验一、 基因组DNA的提取、电泳第一部分：肝组织制备及蛋白酶第一部分：肝组织制备及蛋白酶K K消化消化第二部分：酚氯仿抽提及乙醇沉淀第二部分：酚氯仿抽提及乙醇沉淀第三部分：第三部分：DNADNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳预期结果 1 2 3 4 5Marker总DNA思考题：1. 实验中所用到的各试剂的作用是什么? 氯仿, 乙醇, EDTA2. DNA提取过程中应注意什么？凝胶成像系统：凝胶成像系统：实验二、 PCR扩增特定基因片断实验背景 基本原理PCR操作引物设计注意事项PCR的应用一实验背景 The Nob

3、el Prize in Chemistry 1993二PCR基本原理 3535355355 在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。n反应分三步： 变性（denaturation）； 退火（annealing）； 延伸（extension）DNA 模板 1 l10PCR buffer（含MgCl2） 5 ldNTPs (10mmol/L) 1 l5引物 (10mol/L) 1 l3引物 (10mol/L) 1 l去离子水（补足反应体系） 40 l Taq DNA pol. (2U/l) 1 l 轻弹管底混合（用离心机甩一

4、下）轻弹管底混合（用离心机甩一下）注意：最后加入Taq 酶。三PCR 操作 50l在一微量离心管中在一微量离心管中依次依次加入下列试剂：加入下列试剂：PCR仪设定的反应条件：94oC 45 S DNA变性55 oC 45 S DNA复性72 oC 1 min 产物链延伸 25-30个循环后 72 oC 10 min 一般地，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR：介绍：PCR仪如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。仪内发生的反应PCR变性退火延伸55 PCR产物的积累规律

5、在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。 多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。 PCR产物的积累规律示意图 PCRPCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。反应成功扩增的一个

6、关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引取决于引物与模板的特异结合。物与模板的特异结合。 PCRPCR反应中有两条引物，即反应中有两条引物，即55引物和引物和33引物。引物。（四）、PCRPCR引物的设计引物设计 的 基本原则引物的设计实例 ( () ) PCR 引物设计 的 基本原则 1 1、引物的引物的方向方向永远是永远是 5 5 33 引物长度一般为引物长度一般为15-4015-40个核苷酸。个核苷酸。 过短会使过短会使PCRPCR的特异性降低；过长没有必要。的特异性降低；过长没有必要。 2 2、引物中的碱基尽可

7、能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。积现象。 引物中引物中G+CG+C的含量在的含量在45-55%45-55%左右。左右。 设计引物时要考虑设计引物时要考虑33端和端和55端端 引物具有相似的引物具有相似的TmTm值。值。 Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物长度要确保值不低于。引物长度要确保值不低于5454C C。 3 3、引物内部不应存在互补序列，以避免折叠成发夹结构、引物内部不应存在互补序列，以避免折叠成发夹结构，尤，尤其引物末端应其引物末端应无回文结构。无回文结构。按经验，引物自身存在的连续互按

8、经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不达到补序列，一般不达到 4 bp4 bp。 4 4、引物间不应存在互补序列。、引物间不应存在互补序列。尤其尤其3 3端，以免形成端，以免形成引物二聚引物二聚体体。Primers That Form Hairpins A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin. The 3 end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA.5-GTTGACTTGATA | |

9、| | | T 3-GAACTCTPrimers That Form Dimers Primer pairs should be checked for complementarity at the 3-end. This often leads to primer-dimer formation with itself or with the other primer. Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase.5-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3 | | |

10、 | | | | | | | 3-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-55 5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。 与模板之间的特异性结合序列一般不少于与模板之间的特异性结合序列一般不少于15-18bp15-18bp，6 6、引物、引物3 3端是端是DNADNA延伸的起点，因此一定要严格与模板延伸的起点，因此一定要严格与模板DNADNA配对。配对。 尤其是引物尤其是引物33末端连续末端连续8 8个碱基要求个碱基要求与模板严格互补与模板严格互补。 但引物的但引物的33端最好没有连续端最好没有连续3 3个个G G和和C C。否则会使引物在模板的

11、。否则会使引物在模板的G+CG+C富集序列区错误配对。富集序列区错误配对。7 7、引物的、引物的3 3端为端为A A为最佳。为最佳。 避免为三联密码的第三个碱基。避免为三联密码的第三个碱基。 引物引物33端的从结合的角度讲最佳碱基选择是端的从结合的角度讲最佳碱基选择是G G和和C C。因为它们。因为它们形成的碱基配对比较稳定，但如果结合错误，可能还会延伸。形成的碱基配对比较稳定，但如果结合错误，可能还会延伸。 PCR 引物设计 的 基本原则（续）3 of G or C bases at 3 end. This may stabilize nonspecific annealing of the

12、 primer. a 3 thymidine is more prone to mispriming than the other nucleotides. 表表1 1 引物与模板引物与模板3 3端错配时端错配时Taq polTaq pol的延伸效率的延伸效率 引物引物3 3端碱基端碱基模板模板3 3端碱基端碱基T 1.0 1.0 1.0 C 1.0 0.01 1 1.0G 1.0 1.0 0.01 A 1.0 0.05T C G A8 8、引物的、引物的55端可以修饰。端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，如附加限制酶位点，引入突变位点，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在加

13、入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCRPCR的起的起始反应中，引物始反应中，引物55端游离的碱基并不影响引导新生链端游离的碱基并不影响引导新生链DNADNA合合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到的序列被带到PCRPCR产物的双链中去，所以如此引物参与的产物的双链中去，所以如此引物参与的PCRPCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。 PCR 引物设计 的 基本原则（完）(1)specificity: conserved genomic

14、 region. 3小时，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比Taq DNA聚合酶高12倍。35 proofreading exonuclease activity. with greater accuracy. no extra A.（3.3）Vent DNA聚合酶半衰期：100 oC ，95分钟 97.50C ， 130分钟其扩增产物的长度可达1013kb。活 性：具有35外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为1/31000，忠实性比TaqDNA聚合酶提高510倍。（3.4）Tth DNA聚合酶半衰期：95 0C，20分钟 活 性： 具有逆转录酶活性，可简化RT-PCR。 但不具3

15、5外切酶活性，没有校对功能， 催化聚合反应的错误掺入率为1/500。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。 4、 10 X PCR buffer 5 l Buffer: 10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8, 20)。 5、Mg 2+： 2025mmol/L 3 l For Taq polymerase activity. 镁离子浓度：镁离子浓度：1.52.0 mmol/L Concentration:too Low: low activitytoo High: non-specific amplification

16、Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。 Mg2+ 浓度过低，会显著降低酶活性。 Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。 镁离子浓度：1.5mmol/L Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。 Mg2+ 浓度过低，会显著降低酶活性。 Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。 在PCR反应中，引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响Taq DNA聚合酶的活性。 常用1.5mmol/L 。 当反应体系中含有高浓度的当反应体系中含有高浓度的 primers、dNTP、EDTA 时时: 上述分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+ 浓度，从

17、而影响Taq DNA聚合酶的活性。 Vary Mg2+ in steps of 0.5 mM Within 1.55.0 mM; Sometimes a compromise between yield and specificity. dNTPs 贮备液：浓度为 10 mmol/L。（注： dNTP 具有较强的酸性，使用时应用1mol/LNaOH将pH值调至中性(7.07.5)。分装，20存放，反复冻融会使dNTP降解。 在PCR反应中，dNTPs浓度在20200mol/L。 dNTP浓度过高会增加非特异性配对碱机的错误掺入率。 低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，减少PCR产物量，但可提

18、高反应的特异性及实验的精确性。 4种 dNTP 浓度应相同: 错误碱基的掺入率降至最低。1 l; 2kb gene : 2 l 6、底物: dNTPs（脱氧核苷三磷酸） (10mmol/L ) 1 l （被稀释了 50 倍, 即浓度：200 mol/L） 7、 添加剂： DMSO（二甲基亚砜） 2.5 l 相当于将 但1010的DMSODMSO会对聚合酶活性产生不良影响。 加入适量二甲基亚砜（终浓度： 5）有利于引物、模板的解链，减少其二级结构，1）为什么有时候需要进行热启动？（二）、PCR 反 应 条 件热启动：Taq DNA聚合酶在DNA双链充分打开之后再加入PCR反应体系中；使模板DNA

19、、引物变性充分；避免发夹结构或其它二级结构影响引物的退火，使引物顺利地、特异性地结合到模板上热启动结束后暂停PCR反应，在PCR仪上直接趁热加入DNA pol。Optimizing the PCR Reaction program 变性温度： 一般选用94 95 。变性时间： 可根据模板长短、G和C含量确定， 一般采用30秒。 2）变性但过高或时间过长都会导致酶活性损失。但过高或时间过长都会导致酶活性损失。Half life of Taq DNA polymerase： 92.5oC 2h， 95oC 40mins， 97oC 5mins. 30 cycles will need 15 min

20、 3）退火温度和时间PCR的基本流程：94oC, 45 sec55oC, 1 min72oC, 2 min 退火温度的变化是根据引物的GC比例、引物的长度调整的。AnnealingFrom 45oC to 60oC. Usually it is around 55 for 1 min. (a) Annealing temperature is too highPrimers and templates remain dissociated.(b) Annealing temperature is too low.Mismatched hybrid.(c) Correct annealing t

21、emperature.Priming occures only at the desired target sites.How to decide annealing temperature?(a) (b) (c) 温度越高，特异性 (specificity)越高。Tm (melting temperature) : at this temperature, the correctly base-pair dissociates (melts).Calculate the Tm of a primer() :Primer: 5-AGACTCAGAGAGAACCC-3Tm = 4 ( G+C)

22、+ 2 ( A+T) = 4 9 + 2 8 = 36 + 16 = 52 Annealing temperature is 14 below the Tm Two primers : identical /similar Tm (above 60 ) Temperature must be confirmed practically.引物中G、C含量高、长度长时，应提高温度。cycles温度：温度：72，74，是 Taq 酶的最适工作温度。时间：时间：1000bp/1min: 25 kb. Requires modified reaction buffer, cocktails of pol

23、ymerases, and longer extension times.六、六、 常见问题与对策常见问题与对策 无扩增产物-假阴性1. 1. 模板模板: : 提取的模板核酸中含有杂蛋白质、 酚、EDTA等抑制了Taq酶活性 too much or too little 原因2.2.引物：引物：选一个好的引物合成单位。选一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳， 两引物带的亮度应大体一致两引物带的亮度应大体一致，如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物发生降解引物发生降解: 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放4 导致引物变

24、质降解失效。引物设计不当引物设计不当: 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度： 浓度过高可降低PCR扩增的特异性， 浓度过低则影响PCR扩增产量, 甚至不出扩增条带。酶失活： 酶的失活， PCR时忘了加Taq酶。变性不彻底：变性温度低，变性时间短。退火温度太高，延伸时间太短PCR仪温度的准确性。设立阳性对照 假阴性 假阳性假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物PCR污染原因实验室中克隆质粒的污染 、PCR扩增产物污染 实验室中加样枪、白大衣、 PCR试剂的污染实验室中气溶胶污染 标本间交叉污染PCR污染： 极微量的污染便可导致假阳性1) 打

25、开离心管前 应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。 开管动作要轻，以防管内液体溅出，防止防止将将靶序列靶序列溅出离心管外，防止将溅出离心管外，防止将靶序列靶序列吸入加样枪内吸入加样枪内，造成实验室污染；2)2) 除了除了酶等不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。消毒。手套、手套、离心管及枪头离心管及枪头(质量好）等一次性使用等一次性使用, ,不要不要碰到别处。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。3) 3) 各种试剂先进行分装，低温贮存。各种试剂先进行分装，低温贮存。防止污染的方法防止污染的方法阴性对照标本对照:被检的标

26、本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染 阳性对照 4）设立适当的对照 合理分隔实验室合理分隔实验室 隔离的专用操作区、专用加样器 标本处理区; PCR反应液制备区; PCR循环扩增区; PCR产物鉴定区. 非特异性扩增 现象：现象：1 1）PCRPCR扩增后出现的条带与预计的扩增后出现的条带与预计的大小不一致；大小不一致；2 2）或者同时出现特异性扩增带与非或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。特异性扩增带。 1) 1) 引物特异性差引物特异性差, , 引物与靶序

27、列不完全互补、或形成引物二聚体。 其对策: 必要时，重新设计引物。 2) 2) 模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高 3) 3) 酶量过多或质量不好酶量过多或质量不好 4) Mg4) Mg2+2+浓度偏高浓度偏高 5) 5) 退火温度偏低退火温度偏低 6) 6) 循环次数过多循环次数过多 原因 非特异性扩增 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态 M 1 21) 1) 模板不纯或降解模板不纯或降解2) Buffer2) Buffer不合适不合适3) 3) 退火温度偏低退火温度偏低4) 4) 酶量过多或质量差酶量过多或质量差5) dNTP5) dNTP、MgMg2+2+

28、浓度偏高浓度偏高6) 6) 循环次数过多循环次数过多 原因 拖尾 如果是在低分子量部分有smear, 可能是引物dimer,应当减少引物量，或更换引物。 如果是在高分子量部分有smear, 可能是高分子的DNA模板，应减少模板量，或减少循环数。 注意：PCR产物一定要从胶上回收后再用。PCR的应用研究 基因克隆，DNA测序，分析突变诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断肿瘤 各种肿瘤检测 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医 犯罪现场标本分析其他总之，希望大家尽可能快地突破技术屏障，掌握技术上的一些看似微不足道、但却是成功秘诀的技巧。祝大家学会沟通使学习更顺畅！实验结束后整理实

29、验台,值日生值日!思考题：思考题：dNTPdNTP的浓度对的浓度对PCRPCR有什么影响？有什么影响？PCRPCR的概念、的概念、PCRPCR的原理（的原理（How PCR works)How PCR works) 引物设计时应遵循的原则引物设计时应遵循的原则（实例（实例) )【】变性温度和时间退火温度与时间延伸时间、循环次数Template dNTPspfu polymerasePCRPCR反应条件的优化反应条件的优化分子生物学软件在引物设计中的应用分子生物学软件在引物设计中的应用(new)(new)PCRPCR实验中的常见问题及对策实验中的常见问题及对策1假阴性，不出现扩增条带2假阳性3出

30、现非特异性扩增带4出现片状拖带或涂抹带Primer should be designed based on exon sequence for PCR.1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性

31、子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束实验一、 基因组DNA的提取、电泳第一部分：肝组织制备及蛋白酶第一部分：肝组织制备及蛋白酶K K消化消化第二部分：酚氯仿抽提及乙醇沉淀第二部分：酚氯仿抽提及乙醇沉淀第三部分：第三部分：DNADNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳预期结果 1 2 3 4 5Marker总DNA凝胶成像系统：Primers That Form Hairpins A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin. The 3 end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the t