植物组织培养母液的配制与保存

1、植物组织培养母液的配制与保存目的熟练掌握植物组织培养中各种成分或成分组的母液（比需要量大若干倍）的配制方法。 实验仪器电子天平（感量为0.0001g）、一般天平（感量为0.1g）、烧杯100mL 50 mL 25mL）、量 筒（1000 mL 100 mL 50 mL ）、容量瓶200 mL 100 mL 50 mL 25 mL ）、细口瓶（500 mL 200 mL 100mL 50 mL）、药勺、玻棒、电炉等。 实验试剂按培养基配方准备实验原理一）培养基的组成培养基是植物组织培养中的-a液血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长 与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。自然

2、状态下生长的绿色植物由于 自身能进行光合作用，并且能合成植物生长发育所需的几乎所有有机成分，加上土壤中含有较全面的无机和有机营养成分，所以只需在适当的时候施加少量的无机和有机肥（复合成 分），植物就可良好的生长。目前所使用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。例如，White培养基是Uspenski和Uspenskaia （1925）的藻类培养基演化的结果，被广泛用于根的培养；Cautheret培养基是建立在Knop营养液（1865）基础上的。以后的培养基大部分是在White和Cautheret培养基的基础上改进而成。就目前所使用的各种培养基而言，可将它

3、们的成分划分为几大类，常用的有MS、B5、和White培 养基等。1.水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。 配制培养基母 液时要用蒸储水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。 大规模生产 时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸储水，以防成分的变化引起不良效果。2.无机营养成分：大量元素，主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种 微量元素：培养基的微量元素主要包括铁（Fe）、镒（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、氯（Cl）、硼（B）和钳（Mo）等。这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或 酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。3.有机

4、营养成分（包括维生素，氨基酸及其它有机物质等）维生素：硫氨素（维生素B1）盐酸毗哆醇（维生素B6）和烟酸 在部分培养基中还添加维生素BX（氨酰苯甲酸）、维生素C（抗坏血酸）、维生素E（生育酚）、维生素H（生物素）、 维生素B12（割钻胺酸）、维生素BC（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙和氯化胆碱等 维生素。氨基酸：甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（环己六醇）也是一些培养基的添加成分。 其他：在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物等。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要 作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由C

5、a介导的信号转导。4.碳水化合物所有的植物组织培养基都需要有碳水化合物作为能源，用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，高者可达5%,亦可用市售的白糖所 代替，但一般应增加用量，而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性。5.植物生长调节物质（常称为激素）：生长素类有：NAA（荼乙酸）、IAA（呵噪乙酸）、旧A（呵噪丁酸）、NOA（荼氧乙酸），P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2, 4-D （2, 4-二氯苯氧乙酸），2,4, 5-T（2, 4,5-三氯苯氧乙酸）等；细胞分裂素类主要有：从甜玉米未成熟种子或其他植物中分离到的玉米素6- （4-羟基-3-甲基-反式

6、-2-丁烯氨基）喋吟。人工合成的细胞分裂素主要有激动素（KT, 6-味喃氨基喋吟）、6-节基腺喋吟（6-BA）、2IP（异戊烯氨基喋吟）和TDZ （thidiazuron,嚷二哩苯基服）等。细 胞分裂素常常与生长素相互配合， 用以调节细胞分裂， 细胞伸长， 细胞分化和器官形成；赤霉素： 主要是GA3,虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基 中很少添加，因为它的作用往往是负面的； 乙烯等。6.琼脂或其他支持物除液体悬浮培养外，就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。一般浓度0.4%-1%,质量越差的琼脂用量越大。7.其他添加剂（含天然提取物、抗生素等）活性炭渗透调节剂抗生

7、素抗氧化剂等二）培养基的选择选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方 面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合与许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White培养基适合于根的培养。实验内容与步骤一）MS大量元素母液的配制一般将大量元素分别配制成10倍的母液，使用时再分别稀释10倍。依次分别称取：NH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO41.70gMgSO4 7H2O 3.7gCaCl2 2H2O4.4g共配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。二）

8、MS微量元素母液的配制一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取：KI0.083gNa2MoO4 2H2O 0.025gH3BO30.62gCuSO4- 5H2O0.0025gMnSO4 H2O1.69gCoCl2 6H2O 0.0025gZnSO4 7H2O0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。CuSO4 5H2O和CoCl2 6H2O由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。分别称取CuSO4- 5H2O0.05g CoCl2 6H2O 0.05g各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。三）MS有机质母液的配制一般配制成10

9、0倍MS有机母液。依次称取肌醇10g盐酸硫胺素（VB1）0.01g烟酸0.05g甘氨酸0.2g盐酸毗哆醇（VB6）0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。四）MS铁盐母液的配制一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取：EDTA二钠3.73g和FeSO4 7H2O 2.78g,配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。五） 几种生长调节物质的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸

10、溶解，然后再加蒸储水定容。一般取100mg配成100ml母液。母液的保存：一般将以上配制好的各种母液保存在4C左右冰箱内。注意事项1.称量要精确2.配制母液时要注意药品溶解的先后顺序，以免发生化学反应，使的产生沉淀。附：MS培养基母液的配制与保存仪器与用具1、 仪器：各类夭平、磁力搅拌器、冰箱等。2、 用具：烧杯、容量瓶、量筒、试剂瓶、标签等。3、 试剂：95%酒精，0.1-1 NaOH, 0.1-1NHCl，配制MS培养基所需的各种无机物、有机物, 蒸储水。方法步骤（一）母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10-100倍的溶液。优点：（1）保证各物质成分的准确性。（2）

11、便于配置时快速移取。（3）便于低温保藏。1、MS大量元素母液（10X）称10升量溶解在1升蒸储水中。配1升培养基取母液100ml。化学药品1升里10升量NH4NO31650 mg/L16. 5gKNO31900 mg/L19. 0gCaCl2 2H2O440 mg/L4. 4gMgSO4 7H2O370 mg/L3. 7gKH2PO4170 mg/L1. 7g2、MS微量元素母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸储水中。配1升培养基取母液10ml。化学药品1升里10升量_|MnSO4 4H2O(MnSO4 H2O)22. 3 mg/L(21. 4 mg/L)223mgZnSO4- 7H2

12、O8. 6 mg/L86mgCoCl2 6H2O0. 025mg/L0. 25mgCuSO45H2O0. 025 mg/L0. 25mgNa2MoO4 2H2O0. 25 mg/L2. 5mgKI0. 83 mg/L8. 3 mgH3BO36. 2 mg/L62 mg注意：CoCl2 6H2O和CuSO4 5H2O可按10倍量（0. 25 mgX10=2 . 5 mg）或100倍量（25 mg）称取后，定容于100ml水中，每次取10ml或1ml,（即含0. 25 mg的量），加入到母 液中。3、MS铁盐母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸储水中。配1升培养基取母液10ml。化学药品1

13、升里10升量Na2 EDTA37. 3 mg/L373 mgFeSO4 7H2O27. 8 mg/L278 mg注意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸储水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适 当加热。混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产 生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。4、MS有机物母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸储水中。配1升培养基取母液10ml。化学药品1升里10升量烟酸0. 5 mg/L5mg盐酸毗哆素（VB6）0. 5 mg/L5mg盐酸硫胺素（VB1）肌醇100 mg/L1 g甘氨酸2 mg/L20mg5、生长调节剂单独配

14、制，浓度为1-5 mg/ml（书中为0. 5 -1mg/ml ）,一般配成4 mg/ml。配制培养基母液时注意事项：1一些离子易发生沉淀，可先用少量蒸储水溶解，在按配方顺序依次混合；2配制母液时必须用蒸储水或重蒸储水；3药品应用化学纯或分析纯；4溶解生长素时，可用少量0. 5 TN的NaOH或95%酒精溶解，溶解分裂素类用0. 5 TN的HCl加热溶解。（二）母液的保存1、装瓶：将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩 倍数、日期。注意将易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。2、贮藏：4C冰箱。附：组织培养室操作程序一. 生产环境1.工作人员进入组培室必须穿工作服

15、，包括更换拖鞋、穿白大褂，接种人员还要带帽、带 口罩。2.所有人员在组培室内不准高声喧哗、打闹。3工作期间，各生产房间要关闭房门，尤其是接种间；工作人员出入要随手关门。4各种生产用品要安固定的位置排放整齐，不可乱拿乱放。5工作过程中所产生的垃圾要及时清理，尤其是接种间，其内垃圾停留时间不得超过4小时。二. 接种程序1.准备工作：接种人员在正式接种之前要做好准备工作，包括准备酒精灯、新洁尔 火、火菌用脱脂棉以及准备接种工具、分取培养基、接种用苗和工作台火菌等。酒精灯用工业酒精作燃料，而非75%酉精。工作台上用的新洁尔灭浓度是0.1%,而非0.01%。工作台灭菌包括两步：一是上台前用紫外灯照射30

16、分钟，二是正式接种前再用新洁尔灭仔细擦一遍。-培养皿的取放： 从布包里取培养皿时， 一定要注意， 手不能接触培养皿的边 沿，同时要尽可能减少与培养皿的接触面，一般规定只能用双手的拇指和食指取 放。-接种工具灭菌也分两步，一是用灭菌布包裹好，在高压锅里灭一次，这一步由灭菌人员负责完成；二是在工作台上，从布包里取出后，先用酒精擦拭一下，再放 在酒精灯火焰上灼烤一遍，其要求是工具的每一点在火焰上灼烤时间不得少于5秒钟。在工具灭菌之前，工作人员的手部，包括手腕，都要用酒精仔细擦拭一遍。2接（转）苗：包括取苗、切苗和接苗三步。取苗：先解开培养瓶的瓶盖（封口膜），如果不能一次取出其内的全部材料，要 先把封

17、口膜（瓶盖）口对者风源放在酒精灯的左前方，然后把瓶口在酒精灯上烤710秒；正式取苗时，瓶口不要斜向外；一次取苗不可太多，以免风干。切苗：培养皿放在离风窗1020厘米处，不可太往外；镶子和手术刀都不可太热，最好是凉的，且在操作过程中，刀和镶都要培养皿斜上方操作，不可在其正上方 操作；在切苗过程中产生的垃圾可堆放在培养皿内的一侧位置上，若非迫不得已，不 可弄到培养皿外。接苗：培养瓶盖（或封口膜）的放置方法和及瓶口灼烤方法与取苗时的相同，烤 完瓶口后，要先倒掉瓶内多余的水分，然后在接苗；接苗时，镶子最好不要与瓶口接 触，一瓶内一般接56棵苗，不要放得太多；组培苗在瓶内要排放均匀、整齐、美 观。封口、记录：封口膜要及时捆绑，其松紧度以用手转不动为准；下台前要把品种 代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。离开之前还要把工作台收拾 干净，把接种过程中产生的垃圾清理掉，台上的物品也要摆放整齐。三组培苗的管理1.瓶苗要整齐的摆放在自己的组培架上，不可乱放。2.接种人员每天都要统计自己的接种数量，包括转前瓶数和转后瓶数。3.值日人员要定时开灯、关灯，保证组培苗有足够的光照时间，但也不可过长，以 每天14小时左右为宜。四.接种用具的清洗1.洗刷培养瓶、培养皿：第一步：把培养瓶培养皿放入洗洁净溶液里，先用毛刷清洗内部，再用钢丝球把外面的字清