分子生物学实验设计蚕豆病

1、分子生物学实验设计蚕豆病分子生物学实验设计蚕豆病2021/4/272案例：案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。临床表现：临床表现： 体格检查：体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。2021/4/273病例样本病例样本标准值标准值意义意义红细胞红细胞1.981012/L 4.34.51012/L 血红蛋白血红蛋

2、白53g/L 170-200 g/L 血清总蛋白血清总蛋白85.5mol/L 5.1318.8mol/L 结合胆红素结合胆红素13.7mol/L 1.716.84mol/L 未结合胆红素未结合胆红素71.8mol/L 3.4211.96mol/L 尿蛋白尿蛋白（+） () 轻度蛋白尿轻度蛋白尿潜血潜血(+) () 血管内溶血血管内溶血尿胆红素尿胆红素() () 尿胆原素尿胆原素(+) 少量少量 实验室检查：实验室检查：2021/4/2741 1、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初 步判断患儿是何种疾病？步判断患儿是何种疾病？2 2、请设计实验进一步明

3、确诊断。、请设计实验进一步明确诊断。3 3、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。查结果。必答题：必答题：5 5、 患者体型瘦小与该病症是否有关，为患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？什么？选答题：选答题：2021/4/275恶心、呕吐、面色苍白恶心、呕吐、面色苍白 皮肤及巩膜黄染皮肤及巩膜黄染 红细胞红细胞 1.981012/L 血红蛋白血红蛋白53g/L 血清总胆红素血清总胆红素85.5mol/L 尿蛋白（尿蛋白（+） 尿胆红素尿胆红素() 尿胆素原尿胆素原(+) 尿液镜下未见红细胞尿液镜下未见红细胞 黄疸黄疸红细胞膜不完整，已破裂红细胞膜

4、不完整，已破裂红细胞含量少红细胞含量少含量明显增加含量明显增加血红蛋白量减少血红蛋白量减少排尿呈酱油样色排尿呈酱油样色游离胆红素增加游离胆红素增加溶血性黄疸溶血性黄疸初步诊断为：红细胞葡萄糖初步诊断为：红细胞葡萄糖-6-6-磷酸磷酸脱氢酶（脱氢酶（G6PDG6PD）缺乏症（蚕豆病）缺乏症（蚕豆病）肠肝循环增多肠肝循环增多1.1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？儿是何种疾病？ 症状症状正常红细胞正常红细胞溶血性贫血溶血性贫血 红细胞红细胞2021/4/276蚕豆病简介蚕豆病简介l蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-P

5、D）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。 易发人群易发人群l多见于儿童，男性患者约占90%以上。 发病机制发病机制G6PD NADPH+H+ GSH 红细胞的抗红细胞的抗 氧化能力氧化能力发生溶血发生溶血左：健康新生儿左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）（黄疸）2021/4/277早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常

6、，约50%患者脾肿大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于12日内死亡。 主要临床表现：主要临床表现：2021/4/2782 2、设计实验进一步明确诊断。、设计实验进一步明确诊断。贫血、黄疸有和无遗传史无或有诱因（食用蚕豆、服用药物、感染）体征：脾肿大、黄疸血常规检查血清学检查检查HA的病因G6PD筛选试验G6PD确诊试验Hb、网织红细胞间接胆红素尿胆原游离Hb结合珠蛋白怀疑其他HA,相应病因检测结果正常G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定G6PD基因分析其他筛选试验高铁血红蛋白还原试验初诊或确诊G6PD缺陷症确诊溶贫（血管内溶血）确诊G6PD做1项或2项做1项2021/

7、4/279高铁血红蛋白还原试验筛选试验确诊试验G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定实验名称：实验名称：2021/4/2710高铁血红蛋白还原试验高铁血红蛋白还原试验实验一实验一2021/4/2711实验原理实验原理 在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白高铁血红蛋白在在高铁血红蛋高铁血红蛋白还原酶白还原酶的作用下又被还原为的作用下又被还原为亚铁血红蛋白亚铁血红蛋白。在这过程中，。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝亚甲蓝作为递氢体，还需要作

8、为递氢体，还需要由由G6PD参与磷酸戊糖途径形成参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上作为辅酶才完成上述反应。所以，述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其缺陷症的患者其MHb还原率下降还原率下降（分光光度技术）（分光光度技术）亚铁血红蛋白亚铁血红蛋白NADPH(辅酶辅酶) 亚甲蓝亚甲蓝(递氢体递氢体) 高铁血红蛋白还原酶高铁血红蛋白还原酶高铁血红蛋白高铁血红蛋白（实验方向）2021/4/2712 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液、 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液、混合液 （等量+）、生理盐水、抗凝剂紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支 主要试

9、剂和仪器主要试剂和仪器 主要试剂：主要试剂：仪器：仪器：2021/4/2713实验操作流程实验操作流程取静脉血1. 8mL 于抗凝管，混匀抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg)离心沉淀 1000 r/ min 15 min调整 血细胞 血浆=1 1 ，混匀 调整后全血（备用）1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 1ml 0.14 mmol/ L 亚甲基蓝液混匀 混合试剂混合试剂（备用）2021/4/2714取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入试剂高铁血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/ mL 0. 01 /

10、 /生理盐水/ mL / 0. 01 /0. 18 mol/ L 亚硝酸钠- / / 0. 010. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1来回摇动1520 次,置37 水浴箱静置3 h蒸馏水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 试剂 A B SB管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管及“S”管吸光度2021/4/2715计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb % = (1 - A/ S) 100 % 2021/4/2716注意事项注意事项1、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。 应将血细胞比容调整到0.35-0

11、.402、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等 应无菌3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果， 故应2h内送检4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏2021/4/2717结果分析方法结果分析方法正常值：MHb还原率=75%，脐血=77% 临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者： MHb还原率 30% 脐血 40% 杂合子患者： MHb还原率 31%74% 脐血 41%76%2021/4/2718实验二实验二G6PD荧光斑点试验荧光斑点试验2021/4/2719实验原理实验原理 葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖

12、（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性 G6P6PGAG6PD NADPNADPH2021/4/2720 反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀长波紫外灯、滤纸、水浴箱主要试剂和仪器主要试剂和仪器 试剂：试剂：仪器：仪器：2021/4/2721实验操作流程实验操作流程取试管，加10l全血+100l反应液，混匀，取一滴于滤纸上（第一斑点 ）作为

13、对照将上液置于37水浴10min ，再取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）实验组 晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时 根据结果作出相应诊断2021/4/2722注意事项注意事项1、检测的第一点作为实验对照应无荧光或弱荧光出现2、每次试验应用正常标本（已知G-6-PD正常）作阴 性对照。如可能选用已知G-6-PD缺乏者的标本作 阳性对照3、如贫血严重取血量应相应加大，或用红细胞混悬液 进行检验4、为提高敏感性可在反应液中加入1份8.0mmol/L GSSG2021/4/2723结果分析结果分析正常人： 0min斑点无荧光，5-10min出现， 10min荧光最强临床诊断： 轻度缺陷者：

14、0-10min荧光很弱或不出现 中度缺陷者：10-30min出现荧光 严重缺陷者：30min内不出现荧光2021/4/2724实验三实验三红细胞红细胞G6PD活性测定活性测定2021/4/2725实验原理实验原理 基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次），求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。方法：WHO推荐的Zinkham;NBT定量法等2021/4/2726 生理盐水、溶血素 、3.8mmol/L NADP 、0.5mol/L Tris缓冲液（p

15、H7.5） 、0.63mol/L氯化镁溶液 、33mmol/L G-6-P液 紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管 主要试剂和仪器主要试剂和仪器试剂：试剂：仪器：仪器：2021/4/2727实验流程实验流程取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心 10min）除去上清液和乳白层（白细胞和血小板）加等体积生理盐水红细胞悬液红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min 溶血液并测定其Hb浓度进行比色 （见下表）2021/4/2728 G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 )试管 对照管 测定管 NADP液（ml） 0.1 0.1Tris液（ml） 0

16、.1 0.1氯化镁液（ml） 0.1 0.1蒸馏水（ml） 0.68 0.58G6P液（ml） 0.1 37预热溶血液（l） 20 20立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化2021/4/2729计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =A/min1000/6.221020/20 Hb(gL-1) A/min:每min吸光度的平均变化值1000/6.22:为微摩尔消光系数1020/20:总容量与溶血液的量之比； 2021/4/2730注意事项注意事项 1、急性溶血期后23个月再查或复查G6PD活性 2、最好同时作阴性对照和阳性对照（影响因素多） 3

17、、离心沉底后应取底层红细胞测定 G6PD活性2021/4/2731结果分析结果分析G6PD缺陷者： G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断方法 正常值范围WHO推荐的Zinkham （12.012.09)IU/gHb(37)ICSH推荐的Glock与McLoan法 （8.341.59）IU/gHb(37) NBT定量法 （13.130.0）NBT单位Chapman和Dern法 （2.87.31）IU/gHb(25)2021/4/2732根据实验结果根据实验结果该男孩患蚕豆病该男孩患蚕豆病2021/4/27333.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。从生化代谢解释患儿的临床表

18、现和实验室检查结果。 细胞膜的破坏胆红素的异常342021/4/27 红细胞膜的破坏红细胞膜的破坏n葡萄糖磷酸戊糖途径葡萄糖磷酸戊糖途径葡萄糖葡萄糖 6 磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH + H+磷酸化磷酸化5 磷酸核糖磷酸核糖磷酸磷酸戊糖途径戊糖途径NADPH + H+5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH + H+5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH + H+5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH + H+NADPH维持维持GSH(谷胱甘肽）的正常含量和还原状态谷胱甘肽）的正常含量和还原状态G6PD (6 磷酸葡萄糖脱氢酶）磷酸葡萄糖脱氢酶）起关键作用起关键作用352021/4/27n还原型谷胱甘肽 体内重要的抗氧化剂 保护红细胞膜蛋白的完整性 红细胞膜的破坏红细胞膜的破坏单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬血红蛋白血红蛋白氧化破坏氧化破坏血红素血红素珠蛋白珠蛋白红细胞红细胞362021/4/27 单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬血红蛋白血红蛋白珠蛋白珠蛋白氧化破坏氧化破坏红细胞红细胞氧化破坏氧化破坏红细胞红细胞单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬红细胞红细胞珠蛋白珠蛋白血红蛋白血红蛋白单核吞噬细单核吞噬细胞识别吞噬胞识别吞噬红细胞红细胞血红素血红素珠蛋白珠蛋