一种可快速感受机械力的传感器细胞的理论设计专业技术方案

1、一种可快速感受机械力的传感器细胞的理论设计方案- 机械制造论文一种可快速感受机械力的传感器细胞的理论设计方案一种可快速感受机械力的传感器细胞的理论设计方案张英昊（河南大学生命科学学院，河南郑州 450052 ）摘要 本文利用了两类可对细胞所受机械力进行响应并介导钙离子从细胞外流入胞质的钙离子通道， 从理论上设计一种可响应所受机械力并迅速将机械力转换成适当频率和强度的荧光信号的传感器细胞。基于此种理论基础， 研究了胞质钙离子异常升高诱导的细胞凋亡的两条信号通路。可以敲低或敲除钙凋亡途径中的相关分子，抑制机械力刺激产生的钙离子内流诱发的凋亡作用，从而可以使传感器细胞稳定传代。 关键词机械力；传感器

2、；细胞；融合蛋白生物发酵工程中最常用的工程细胞是各种细菌，放线菌，真菌，酵母等微生物。但是生产一些具有较多转录后修饰的代谢物质，如干扰素，各种细胞因子，糖蛋白，激素等，则不能使用微生物，因为微生物缺乏相关的修饰功能，生产出的物质往往没有活性。因此必须使用动物细胞。 而动物细胞由于对环境比较敏感，比较难在大型生物反应器中培养。 而难以在反应器中培养的一个原因是缺乏能直接反映细胞生理状态的参数的检测。众所周知，生物反应器的标准检测参数是温度， ph ，融氧，以及搅拌器转速。但是以这些有限的物理、化学参数来对应于细胞内复杂而众多的生理状态，显然是无法精确反应实际情况的，尤其是对环境比较敏感的动物细胞

3、，往往是当细胞中众多的实际生理状态已经发生了剧烈变化，使细胞生长不佳甚至大量死亡后，上述的物理，化学参数才会有变化。 因此，发酵中仅靠参数本身往往不能精确判断发酵状态，而是要依赖于操作者的经验。为了能够解决这个问题，笔者考虑设计一种起传感器作用的细胞，它与用于合成代谢物质的细胞一同在生物反应器中培养，享受相同的环境。 但是这种传感器细胞是经过改造的， 它们能够将由于外界环境变化而导致自身内部发生改变的生理信号，直接转化成可被检测装置感受的特定的物理或化学信号，为生物反应器上相应的控制软件提供精确信息，从而对影响细胞生理状态的微环境进行精确检测，并利用即时的反馈调节对生物反应器参数进行精确控制。

4、而本论文研究的是机械力对动物细胞的影响。由于动物细胞没有细胞壁，对机械力是非常敏感的。 然而动物细胞的生长及代谢物的合成都依赖氧气，在生物反应器中为了实现供氧，必须依赖于培养基的不断流动，翻滚，搅拌，这往往会产生变化剧烈的剪切力， 损害细胞。因此，供氧和对剪切力的控制是一对矛盾体，必须平衡考虑。如果能培养出一种能感受所受机械力以及机械力对自身生理状态的影响，并迅速将其转变成特定频率的光信号的传感器细胞，必然对供氧和受力的控制这一过程提供很大帮助。综上所述，本论文根据已有的研究内容， 从理论上设计一种满足如上要求的，可感受机械力的传感器细胞，并提出每一步骤中笔者能想到的可能的处理方法。1 钙离子

5、通道感受机械力的机制研究哺乳动物体内在生理条件下有很多种感受机械力的途径，典型如细胞粘附与胞外基质，其粘附产生的力调控细胞的分化与凋亡；血管内皮细胞与胞外基质粘附，当血液流速过快或血管腔过窄时（即高血压状态），内皮细胞可感受力的状态，从而促使合成舒张血管的NO 前列腺素等物质 1 。经过大量研究，人们公认这些能感受机械力的细胞表面有能够介导胞外钙离子内流的trp家族离子通道，这些钙离子通道介导了机械刺激时胞质内钙离子的升高。但是，需要进一步研究 trp 家族感受机械力的具体机制。研究表明，用含有RGD 的磁珠处理细胞，再加磁场，使磁力作用于整合素上，发现力作用于整合素上时细胞膜显示出了很大的刚

6、性，即抵抗形变， 同时细胞核的形状发生了改变；相对的，用磁珠偶联抗原肽，再加磁场，使力作用于MHC 时，细胞膜显示出了柔性，而且细胞核的形状未发生改变。他们认为机械力通过整合素， 传给了在胞内与整合素相连的细胞骨架，再由细胞骨架传递给细胞核，从而引起细胞核形状变化以及调控基因的表达。而 MHC 由于没有与细胞骨架相连，故受力时细胞膜显示出了柔性。同时，机械力刺激胞外基质ECM ，产生与直接力刺激整合素相同的效果。这些研究阐明了机械力传导的一种基本模式，即：机械力刺激 ECM 整合素细胞骨架调控生理状态另外一些研究显示，用机械力刺激间充质干细胞（刺激方式为使用光镊为偶联在整合素上的小珠施加力）

7、，会引起细胞质内钙离子的明显升高。胞质升高的钙离子有两个来源， 一个是从胞外流入的， 一个是从胞内的内质网流出而进入细胞质的（在胞外无钙的环境中， 向细胞处理内质网上的钙离子通道抑制剂，发现对机械力刺激不会引起胞质钙离子上升）。该研究组发现位于细胞膜上的介导胞外钙离子流入胞质的是trp 家族离子通道 trpm7 。他们研究了细胞骨架扮演的作用：在无 IP3 时，在胞外无钙环境中，用细胞骨架解聚剂处理，发现内质网无法释放钙离子到胞质；而抑制内质网钙通道，在胞外有钙环境中，解聚细胞骨架，发现胞外钙离子也无法流入。 这些研究说明了 trpm7和内质网上的 IP3receptor钙通道对机械力的响应机

8、制正式通过整合素和细胞骨架作用的。事实上，另有文献表明 IP3r 是直接与细胞骨架相连的。他们研究了trpm7和 IP3r 响应机械刺激所需的时间： 在机械刺激细胞上的整合素后，胞外钙离子流入胞内的平均时间是机械刺激后 20 秒，而内质网释放钙离子的平均时间是机械刺激后100 秒。对于这一反应时间的差异， 该研究小组认为是机械力沿着细胞骨架向细胞深处的内质网传递时，细胞骨架要通过一些方式重构来积累足够强度的力学信号，这导致了内质网的钙离子延迟释放。综上，细胞对机械力的感受可分为ECM 整合素、细胞骨架依赖性的胞质钙离子上升和非依赖型的胞质钙离子上升。ECM 依赖性的机械力传导机制可制作传感器细

9、胞用于对锚定依赖性细胞的培养，如作为血管内皮细胞生产前列腺素这一生产体系的传感器细胞， 大致的策略就是适当调整整合素和胞外基质和trpm7离子通道的表达量， 实现钙离子浓度对机械力刺激的最佳响应。不过由于胞内钙离子的上升分别来自胞外和内质网，而内质网释放钙离子， 响应速度较慢且与细胞膜流入钙离子的响应时间差距较大（一个100 秒一个 20 秒），所以从钙离子信号即时性和整齐性的角度考虑，可以敲除或下调内质网上的IP3r 钙离子通道。而 ECM 非依赖性的 Yvc1p 钙离子通道，可用于可悬浮培养的动物细胞的生产体系，比如培养巨噬细胞生产干扰素以及白介素等细胞因子。2 由胞质钙离子变化的生理信号

10、向可检测的光学信号的转化生物体中可检测的光学信号最容易想到的就是荧光蛋白。比较容易想到的一类生理状态转化为光学信号的方式是通过一系列信号转导过程调控荧光蛋白的表达量的变化，从而改变亮度。这些调控转录的途径研究成果非常多，比如camp-creb途径、 CaM CaN NFAT 途径、 Nf-kapa b途径等等。但是改变荧光蛋白的表达量必须走转录翻译过程，而这个过程无疑是很耗费时间的，通常情况下，在多种信号通路中， 适当的信号刺激引起的某种分子的表达量的变化，至少也要五到六个小时才会有明显差异。因此基因表达量调控的方式虽然适合开发药物，但是与细胞传感器即时性的要求是不符合的。故钙离子向光信号转化

11、， 只能依赖化学反应。钙离子成像， 最常用的是一种叫fura-am的染料，该染料是脂溶性的，能透过细胞膜，然后被酯酶分解形成不透膜的fura 留于胞内，与钙离子定量结合，发射荧光。但是这种染料必须人为加入细胞，而无法让细胞自己产生。 而在实际的生产系统中是不可能严格区分生产细胞和传感细胞的，若统一加入染料， 由生产细胞产生的胞内钙荧光，可以想象，会是一种强烈的背景干扰。因此，最好还是只对传感细胞进行改造。根据前人的研究结果，可以使用一种融合的荧光蛋白。该荧光蛋白利用了荧光共振转移（ FRET）原理。事先已大量表达于细胞质中，在为结合与结合钙离子时会拥有不同的构象， 在未结合钙离子时发青光， 结

12、合时发红光。 根据这两种频率光的强度的比值， 可以精确探测出胞内钙离子的浓度。而且这种探测是几乎即时的，因为不涉及转录翻译，仅仅是由于钙离子出现导致的构象变化。3 排除胞质钙离子浓度上升介导的细胞凋亡的影响细胞凋亡是一种相对比较温和的过程， 不发生炎症反应 2 。细胞凋亡上游的影响因素很多， 涉及多种不同的信号级联反应。但它们有共同的下游途径，即激活 bax/bak 蛋白二聚化，定位于线粒体膜，使线粒体膜通透性丧失，内容物流出；然后凋亡又分为 caspase 依赖和非依赖途径，其中依赖途径研究较清楚，即线粒体释放的细胞色素c 和 apaf-1 ，与胞质中 caspase9 ，形成复合体，并激活

13、 caspase3 ，诱导凋亡。而非凋亡途径则由线粒体释放的凋亡诱导因子（aif ）引发，具体机制尚不清楚。 凋亡的最终途径是染色体断裂成小碎片，与细胞器聚集在一起后，被表达有磷脂酰丝氨酸作吞噬信号的质膜包裹成小球，被临近细胞识别吞噬。由于细胞凋亡总伴随着凋亡小体形成，因此可以用TUNNEL 实验，来定量化反应细胞凋亡程度，这也是下面的文献中的凋亡程度的评价方法。而根据已有的研究 3 ，胞质钙离子的异常升高， 是诱导细胞凋亡的一个重要因素。而我们的传感器细胞感受机械力的原理就是胞质钙离子升高，因此必须对细胞感受钙离子的凋亡通路进行研究，并削弱这一通路。 在正常细胞中， 由肿瘤坏死因子结合死亡受

14、体， 激活 caspas8 ，从而切割 bid 为 t-bid（truncated bid），t-bid与线粒体上的 bak/bax结合，在线粒体上形成孔道， 促使线粒体内容物释放诱发凋亡。 而在胞质钙离子升高时， 钙离子会激活钙蛋白酶calpain ，calpain可在 bid 的 gly70 和 arg71 之间切割形成 t-bid （这里使用了 gst-pull down方法，分离切割后的片段，在进行末端测序得到切割位点），进而促使细胞凋亡。而另一条钙离子介导的凋亡通路也被发现，即正常时磷酸化的Bad 蛋白与14-3-3蛋白结合维持细胞存活状态，这种 bad 的磷酸化是由多种上游信号通路

15、介导的其中的两个例子是mapk 家族的 mekk 和蛋白激酶 B(即 akt)4 ；钙离子激活钙调蛋白磷酸酶 （CaN ），使其去磷酸化， 与 14-3-3蛋白解离；解离后 Bad与 Bcl2-bak复合体作用，置换出游离的bak ；游离的 bak 二聚化，暴露bak的 N 末端（该末端可作为抗原表位，能够以荧光抗体的方法衡量bak 的促凋亡活化程度），然后插入线粒体膜，形成孔道释放内容物，诱发凋亡。用calpain的抑制剂处理细胞，在测量二聚化的bax 的量，发现 bax 的表达量不受影响，这进一步证实了钙离子引发的 bid 被切割诱发凋亡和bad 被磷酸化诱导的凋亡分属两条不同的途径。然而

16、，后来又有研究表明，在缺失bak/bax ，只有 t-bid的存在不会使线粒体通透性丧失，而只有bak/bax 没有 t-bid 时 bax 能转位与线粒体但没有通透线粒体的作用，推测与bax 同源的 bak 也有相同的效果。因此 t-bid 是 bax/bak 促凋亡的激活剂 4 。4 结论根据上述文献的结果进行归纳总结，可得出钙离子介导的细胞凋亡的通路如图 1 ：因此，如果要制作传感器细胞， 可以考虑敲除 bid敲除 bax/bakcalpainCaN ，或者可以用低效率的启动子下调这些基因的表达。如上便是可感受机械力的传感器细胞的简要设计方案。相信随着生物产业的发展以及对生物发酵产品的品质要求不断提高，适应于动物细胞发酵条件的精确控制的传感器细胞会大有用武之地。在必要的时候， 可以考虑引入一些特定的支架分子， 它们能够将细胞感受缺氧和营养缺乏的上游信号，不通过经典的调控转录翻译途径，而是将其引向一种人为设计的或者与经典途径不相干的， 可快速反应的新途径， 即对细胞进行信号通路的嫁接和改造。当然，研发能够快速感应生理信号并将其转变为特定可检测的物理化学信号的生物传感分子 (比如本文中使用的荧光探针)也是必不可少的。 参考文献