HIV试验室检测方法和步骤

1、HIV实验室检测方法和步骤1 .目的：为HIV实验室各技术人员统一实验操作程序，保证实验质量，特制定本程序。2 .适用范围：适用于 HIV实验室技术人员。3 .规范性引用文件：全国艾滋病检测技术规范（2004年版）。4 .相关器材设备：人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（双 抗原夹心酶联免疫法）HIV （1+2）。5 安全防护器材与措施：一次性乳胶手套、隔离衣、口罩、帽子，接收或取用试剂时应把试剂视作感染性材料对待。首 先穿好一次性隔离衣，戴好口罩、帽子，最后戴好乳胶手套 后再接触试剂。6 检测方法与步骤6.1 双抗原夹心酶联免疫法6.1.1 试剂名称：人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒6.1.2 试

2、剂厂家：北京万泰生物试剂有限公司6.1.3 原理及用途：采用基因工程抗原gp41和gp36包被酶联板，用基因工程 HIV-1和HIV-2嵌合抗原ENV18标记辣根 过氧化物酶，与其他试剂组成试剂盒，应用双抗原夹心法检 测人血清或血浆中的人类免疫缺陷病毒抗体，用于献血员及 高危人群中人类免疫缺陷病毒感染的筛查。6.1.4.1. 预包被板条12孔X 8/8孔X126.1.4.2. HIV 酶标记物 12mlX1 瓶6.1.4.3. 阴性对照1ml X 1瓶6.1.4.4. 阳性对照1mlX1瓶6.1.4.5. 25倍浓缩洗液80ml X 1瓶用去离子水或蒸储水稀释6.1.4.6. 底物缓冲液8ml

3、X1瓶6.1.4.7. 底物液 8ml X 1 瓶6.1.4.8. 终止液 7ml X 1 瓶6.1.4.9.封口袋 1 个1.1.1.10. 说明书1份6.1.5 操作方法6.1.5.1. 加样：将预包被板条固定于板架上。每次试验设阴性对照2孔、阳性对照2孔，分别加入阴、阳性对照100ul ;设空白对照1孔，不加样品。其余孔加入待测样品100ul o6.1.5.2. 温育：置37c温育60分钟。6.1.5.3. 洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置3060秒，弃去孔内洗液，扣干。重复洗 5次。6.1.5.4. 加酶：空白对照孔不加酶，其余孔加入酶标记物100ul。6.1.5.5.

4、 温育：置 37c温育30分钟。6.1.5.6. 洗涤：弃去孔内酶标记物，重复洗 5次（同操作 步骤3）。6.1.5.7. 显色：每孔加入底物缓冲液50ul ,再加入底物液50ul ,振荡混匀，置37c温育10分钟。6.1.5.8. 终止：每孔加入终止液 50ul ,轻拍混匀。在单波 长450nm或双波长450nm/630nm下，用空白孔校零，再读取 各孔OD®。6.1.6 结果判读96.1.6.1. 要求：阳性对照OD1应> 0.80阴性对照OD值应< 0.08 （空白校零 后）6.1.6.2. 临界值（C.O.）计算：临界值（C.O.）= 阳性对照平均 OD值X 10

5、%备注：阳性对照 OD直大于2.5按2.5计算。6.1.6.3. 结果判定：样品OD值 > 临界值（C.O.）为HIV抗体阳性样品OD值 < 临界值（C.O.）为HIV抗体阴性初筛试验阳性者应重新取样进行双孔复试，按照全国艾滋 病检测工作规范需将血样或重新采血送“HIV筛查中心实验室”进行确认试验。6.2.1 试剂名称：人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒6.2.2 试剂厂家：英科新创(厦门)科技有限公司6.2.3 原理及用途：本试剂盒采用双抗原夹心两部法检测人血清或血浆样本中(HIV 1/2)型抗体.采用多种HIV-1和HIV-2的特异性抗原制作预包被板及酶结合物.当待检样本中存在HI

6、V抗体时，在反应过程中形成“固相 HIV抗原-HIV抗体-酶标记HIV抗原”的免疫复合物,加入底物后形成显色6.2.4.1.孔 )A6.2.4.2.(7ml)B6.2.4.3.(13ml)液6.2.4.4.(1ml)片6.2.4.5.反应.适用于辅助诊断及献血员筛查。6.2.4 试剂盒组份测抗-HIV 酶联板1块 (967.显 色 剂1 瓶(7ml)测抗-HIV 样品稀释液1 瓶8. 显色剂1 瓶(7ml)测抗-HIV 酶标抗原1 瓶9. 终 止1 瓶(7ml)抗-HIV阳性对照(已灭活)1瓶10.不干胶封2张抗-HIV阴性对照(已灭活)1瓶(1ml)11.书1份6.2.4.6.20 X 洗涤

7、液1 瓶（50ml）12.密封袋、干燥齐I1套6.2.5 标本要求 血清或血浆（可用枸檬酸钠、肝素等作抗凝剂）6.2.6 仪器要求酶标仪洗板机恒温箱加液器等6.2.7 检测程序6.2.7.1 .将各种试剂移到室温（18-25 C）平衡半小时后， 取一瓶20X洗涤液，加蒸储水至 1000 ml ,混匀后备用。6.2.7.2 .将酶联板从密封袋中取由，每孔加入1000 ”酶标抗体，设一个空白对照孔，两个阳性对照孔，两个阴性对 照孔。取阳性对照和阴性对照分别充分混匀后各20以l 加入对照孔中，其余每个孔加待检血清20以l ,充分混匀，将酶联反应板置微板振荡器上混合5 - 10秒，用不干胶封片封盖反应

8、板。未用完的板条在密封袋中保存。6.2.7.3 .酶联板置37c温育60分钟，小心吸干孔中血清， 用洗涤液洗5次，然后在吸水纸上拍干。6.2.7.4 .每孔加显色剂 A 50以l ,显色剂B 50以l , 轻轻振荡后置37 C暗处显色30分钟，每孔加终止液 50以l 6.2.7.5 .选择酶标仪测定波长 450nm,用空白孔调零点，测 定各孔OD®。也可选择630 nm作为参考波长，用双波长测 定。6.2.8 结果判定6.2.8.1 . Cutoff值=0.12 +N （阴性对照的平均值）6.2.8.2 .阴性对照OD值大于等于0.10 o6.2.8.3 .阳性对照 OD值大于等于0

9、.80 ,阴性对照 OD值大 于0.1 ,则实验不成立，全部实验重做。6.2.8.4 .标本OD值小于Cutoff值为阴性，大于等于Cutoff 值为阳性。6.2.8.5 .阳性者须重新取样双孔复试，复试阳性者应按全 国HIV管理规范，送HIV筛查中心实验室进行确认。6.2.9 注意事项6.2.9.1 本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。6.2.9.2 整个HIV检测必须符合全国艾滋病检测技术规 范生物安全守则规定，严格防止交叉感染。操作时必须戴 手套、穿工作服，严格健全和执行消毒隔离制度。6.2.9.3 HIV-1/HIV-2抗体测定结果的判定必须以酶标仪读 数为

10、准。6.2.9.4 样品及各种试剂应用加液器加注，并经常校对其准确性。6.2.9.5 洗涤时各孔均需加满洗液，防止孔口有游离酶不能洗净。6.2.9.6 所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。6.2.9.7 微孔板条从冷藏环境中取由时应在室温中平衡至 潮气干尽方可使用，未用完者须放入有干燥剂的密封袋中保 存。6.2.9.8 用于检测的样品应保持新鲜。6.2.9.9 剩余样品及废弃物应经121c高压蒸汽灭菌30分钟，或用5.0g/L次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。6.2.9.10 若倍浓缩洗液由现结晶，请放置37c至溶解。6.2.9.11 结果判读请在15分钟内完成。6.2.9.12

11、不同批号的试剂组份不可混用。6.3.1 试剂名称：人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒6.3.2 试剂厂家：珠海丽珠试剂有限公司6.3.3 原理及用途：本品系用纯化基因工程人类免疫缺陷病毒I型和n型(HIV-1/HIV-2 )抗原(合成肽或基因重组蛋白)包被的微孔板和酶标记的 HIV-1/HIV-2抗原及其他试剂 组成，应用双抗原夹心法原理( Sandwich ELISA )检测人血 清或血浆中的 HIV-1/HIV-2 抗体。6.3.4.1.HIV抗原包被板 12孔X8/8孔X126.3.4.2.HIV酶标记物7m1X1瓶6.3.4.3, 阴性对照Imixi瓶6.3.4.4, 阳性对照imixi瓶

12、6.3.4.5, 20倍浓缩洗液50ml X 1瓶用去离子水或蒸储水稀释至1000ml6.3.4.6, 底物缓冲液7ml X 1瓶6.3.4.7, 底物液 7ml X 1 瓶6.3.4.8, 终止液 7ml X 1 瓶6.3.4.9.封口袋 1 个1.1.1.10. 说明书1份6.3.5 操作方法6.3.5.1. 将试剂盒平衡至室温，取由所需的条板，剩余的即时封存。6.3.5.2. 用去离子水和蒸储水 20倍稀释浓缩洗涤液。6.3.5.3. 将所需数量的条板固定于支架，按顺序编号，设置 样品孔、空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔（每次实验 需设空白对照1孔，阳性对照2孔，阴性对照3孔。）。在

13、样品孔中加入50ul待测样品，空白孔不加任何液体，阴性、 阳性对照孔分别加入 50ul阴性或阳性对照，轻拍混匀。6.3.5.4. 置37c温育30分钟。6.3.5.5. 将孔内液体甩干,置洗板机用洗涤液充分洗涤6遍，扣干。（注：洗涤时各孔要加满洗液，勿使孔间交叉污染。采用洗板机时应设定每遍有60秒的浸泡时间。）6.3.5.6. 每孔加入50ul酶标记物（空白孔除外），轻拍混匀。6.3.5.7. 置37c温育30分钟。6.3.5.8. 将孔内液体甩干，置洗板机用洗涤液充分洗涤6遍，扣干。（注：洗涤时各孔要加满洗液，勿使孔间交叉污染。采用洗板机时应设定每遍有60秒的浸泡时间。）。6.3.5.9.

14、每孔加入50ul底物缓冲液和50ul底物液，轻拍混匀，置37 c避光温育30分钟。6.3.5.10. 每孔加入50ul终止液终止显色反应.6.3.5.11. 用酶标仪单波长450nm （需设空白对照孔，并以 空白对照孔调零）或双波长 450nm/630nm测定各孔A值。6.3.6 结果判定6.3.6.1. , 临界值（Cutoff ） = 0.15 +阴性对照的平均 A值6.3.6.2. .样品的A值A Cut off 值为HIV抗体反应阳性。6.3.6.3. .样品的A值Cut off 值为HIV抗体反应阴性。6.3.6.4. . 正常时，阴性对照 A值应W 0.12 ,阳性对照 A值 应A

15、 0.80 ,阴性对照值若小于 0.08以0.08计算。6.3.6.5. ,若阳性对照A值孔间之差大于 30%应重复实验。6.3.6.6. .初次实验阳性者应重新取样进行双孔复试，按全国HIV检测管理规范的要求，须将血样或重新采血送HIV确认实验室做确认实验，确认报告阴性者，血可以发放使用；凡确认实验阳性和可疑者，血不能发放使用，统一送确认实 验室处理。6.3.7 注意事项6.3.7.1. 本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。6.3.7.2. 整个HIV检测必须符合全国艾滋病检测技术规范生物安全守则规定，严格防止交叉感染。操作时必须戴手套、穿工作服，严格健全和执行消

16、毒隔离制度。6.3.7.3. HIV-1/HIV-2抗体测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。6.3.7.4. 样品及各种试剂应用加液器加注，并经常校对其准确性。6.3.7.5. 洗涤时各孔均需加满洗液，防止孔口有游离酶不能洗净。6.3.7.6. 所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。6.3.7.7. 微孔板条从冷藏环境中取由时应在室温中平衡至潮气干尽方可使用，未用完者须放入有干燥剂的密封袋中保存。6.3.7.8. 用于检测的样品应保持新鲜。6.3.7.9. 剩余样品及废弃物应经121c高压蒸汽灭菌30分钟，或用5.0g/L次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。6.3.7.10. 不同批号

17、的试剂组份不可混用。6.4.1 试剂名称：人类免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗体诊断试剂（乳胶层析法）6.4.2 试剂厂家：艾康生物技术（杭州）有限公司6.4.3 实验原理：本品系用特异性重组HIV1/2抗原gp41和gp36及兔抗HIV1/2多克隆抗体包被硝酸纤维素膜，配以红色乳胶标记重组HIV1/2抗原pg41和pg36及其他试剂制成，应 用双抗原夹心反应原理，定性检测血清/血浆标本思HIV1/2 抗体，用于无偿献血的现场筛查.6.4.4 .试剂组成6.4.4.1. 说明书1份6.4.4.2. 艾康人类免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗体诊断试剂（乳胶层析法）6.4.4.3. 一次性吸管.6.4

18、.5 试验方法：6.4.5.1. 本试剂使用人血清或血浆。检测时应尽量使用新鲜的样本；样本由现浑浊时，通过离心或过滤取上清检测。6.3.5.2.的样品C不能检测含有悬浮纤维蛋白或聚集物、重度溶血6.4.5.3. 样品中应无微生物，无菌分离的样品可以再2-8 C储存1周，长期储存应于-20 C或更底温度条件，避免反复冻融。6.4.5.4. 使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。6.4.5.5. 不能使用放置时间过常、长菌、发臭的标本，这样避免因标本污染而造成的非特异反应。6.4.6 实验方法：在加样处滴加样品 80ul ,平置于室温，30 分钟内看结果，9.6.3.7 结果判定6.3.7.1. 在30分钟后的结果无效。6.3.7.2. 样品视为传染品，注意安全操作。6.3.7.3. 测试卡上显示两条红线时，即可判为初筛实验阳性结果。6.3.7.4. 测试卡从包装中取由后，应在 60分钟内使用，潮湿空气中暴露时间过长将影