第8章DNA复制和修复

1、 第八章第八章 DNA的复制和修复的复制和修复 第一节第一节 染色体染色体第二节第二节 DNA的复制的复制第三节第三节 原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNA的复制特点的复制特点第四节第四节 DNA的损伤和修复的损伤和修复主要讲授内容主要讲授内容第一节第一节 染色体染色体一、染色体（Chromosome) 内容提要：细胞周期染色体与染色质染色体的结构和组成（ 原核生物 、 真核生物）核小体原核生物和真核生物基因组结构特点比较 Cell cycle Cell cycle Interphase 间期间期: G1 + S + G2 M phase (mitosis 有丝分裂有丝分裂):（一）细胞

2、周期连续分裂的细胞从上一次有丝连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程。成所经历的整个过程。包含包含G1期、期、S期、期、G2期、期、M期期四个阶段。四个阶段。 合成RNA和核糖体 合成DNA和组蛋白以及复制所需要的酶。 DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。 （二）染色体与染色质同一物种内每条染色体所带同一物种内每条染色体所带DNA的量是一定的，但不的量是一定的，但不同染色体或不同物种之间变化很大，从上百万个到几亿同染色体或不同物种之间变化很大，从上百万个到几

3、亿个核苷酸不等。如人个核苷酸不等。如人X染色体就带有染色体就带有1.28亿个核苷酸对，亿个核苷酸对，而而Y染色体只带有染色体只带有0.19亿个核苷酸对。亿个核苷酸对。染色体（染色体（chromosome）是细胞在有丝分裂时遗传物质）是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。果。真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质是以染色质(chromatin)的形式存在的。的形式存在的。染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最染色质是一种纤维状结构，叫做染

4、色质丝，它是由最基本的单位基本的单位核小体核小体(nucleosome)成串排列而成的。成串排列而成的。 染色体和染色质在化学组成上（染色体和染色质在化学组成上（DNA和组和组蛋白等）没有差别，主要在于它们空间构蛋白等）没有差别，主要在于它们空间构象不同，这也反映了它们在细胞周期的不象不同，这也反映了它们在细胞周期的不同阶段有不同功能。同阶段有不同功能。作为遗传物质，染色体具有以下特征：作为遗传物质，染色体具有以下特征：分子结构相对稳定；分子结构相对稳定；能够自我复制，使亲代、子代之间保持连能够自我复制，使亲代、子代之间保持连续性；续性；能够指导蛋白质的合成；能够指导蛋白质的合成；能够产生可遗

5、传的变异。能够产生可遗传的变异。（三）染色体的结构和组成（三）染色体的结构和组成（1）原核生物(prokaryote) 的染色体原核生物如细菌染色体位于细胞内的核区中，核原核生物如细菌染色体位于细胞内的核区中，核区外没有核膜。一般只有一条或几条染色体，呈双区外没有核膜。一般只有一条或几条染色体，呈双链闭环结构，长度从链闭环结构，长度从250-35000m不等。不等。染色体裸露，没有组蛋白和其他蛋白质结合，不染色体裸露，没有组蛋白和其他蛋白质结合，不形成核小体结构。比较易于接收带有相同或不同物形成核小体结构。比较易于接收带有相同或不同物种的基因或种的基因或DNA片段的插入。片段的插入。大肠杆菌染

6、色体长为大肠杆菌染色体长为1333m，要装入长约为，要装入长约为2m，宽约，宽约1m的细胞中，因此的细胞中，因此DNA必需以折叠或螺旋的方式存在。必需以折叠或螺旋的方式存在。原核生物原核生物DNA基因组的特点基因组的特点结构简练结构简练：DNA分子的绝大部分用来编码蛋白质，只有一小部分不转录，作为控制基因表达的序列存在。基因种类和数量较少：基因种类和数量较少：以操纵子为转录单元：以操纵子为转录单元：原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往聚集在基因组的一个或几个特定部位，形成功能单位或转录单元，可被一起转录为含多个mRNA的分子，即多顺反子mRNA.组蛋白： H1 H2A H2B

7、 H3 H4非组蛋白核小体DNA蛋白质染色体(2)真核生物染色体的组成组蛋白的一般特性： 进化上的保守性保守程度：H1 H2A、H2B H3 、H41、组蛋白、组蛋白 上海生化所分子遗传学1998年试题： 在真核生物核内。五种组蛋白（H1 H2A H2B H3 和H4）在进化过程中，H4极为保守，H2A最不保守（ ）无组织特异性无组织特异性肽链氨基酸分布的不对称性肽链氨基酸分布的不对称性: :N端均为碱性氨基酸。对于H1相反，C端为碱性氨基酸，N端疏水端。H5H5组蛋白的特殊性：组蛋白的特殊性：富含赖氨酸（24%）：两栖类、鱼类和鸟类 中用来替换H1组蛋白的可修饰性简述真核生物染色体上组蛋白的

8、种类，组蛋白修饰的种类及其生物学意义中国科学院2003年硕士研究生入学生物化学与分子生物学试题 在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修饰作用较普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白所携带的正电荷。所携带的正电荷。这些组蛋白修饰的意义：一是改变染色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间接影响转录活性。组蛋白的可修饰性H2BH2AH3H4a2a3a1a2a3a1a2a3a1a2a3a1L1L2aN *

9、* 组蛋白八聚体（组蛋白八聚体（Histone octamer ） H2AH2A与与H2BH2B、H3H3与与H4H4的亲和力强，的亲和力强， 通过通过C C端的疏水氨基酸结合端的疏水氨基酸结合 两个两个H3H3、H4H4先形成四聚体先形成四聚体 结合两个结合两个H2AH2A和和H2BH2B的异二聚体的异二聚体 组蛋白八聚体组蛋白八聚体 2非组蛋白非组蛋白 是指染色体上与特异DNA序列相结合的蛋白质，所以又称为序列特异性DNA结合蛋白（sequence-specific DNA-binding proteins）。 其酸性氨基酸的量超过碱性氨基酸的量，因此带负电荷。 具有种属和组织特异性 在整

10、个细胞周期中都进行合成，不像组蛋白仅在S期和DNA复制同步进行。功能：功能： 帮助DNA分子折叠，形成不同的结构域，从而利于DNA的复制和转录； 协助启动DNA复制； 特异性地控制基因转录，调节基因表达。（四）核小体（四）核小体（Nuclearsome） * * 染色体结构的第一个层次，构成染色质的染色体结构的第一个层次，构成染色质的基本结构单位基本结构单位 * * 足量的足量的微球菌核酸酶微球菌核酸酶处理染色质可得到处理染色质可得到 146bpDNA 146bpDNA 组蛋白组蛋白 八聚体八聚体核小体的核小体的核核 心颗粒心颗粒 直径约直径约10nm10nm 、核小体的组成、核小体的组成 组

11、蛋白八聚体组蛋白八聚体146bp146bp的的核心核心DNADNA146bp146bp的核心的核心DNADNA在组蛋白八聚体上盘绕在组蛋白八聚体上盘绕1.751.75圈圈Mononucleosomes typically have 200 bp DNA. End-trimming reduces the length of DNA first to 165 bp（含组蛋白H1）, and then generates core particles with 146 bp. 微球菌酶处理微球菌酶处理所得核小体所得核小体DNADNA长长度的变化度的变化Chromatosome166 bp, 2 s

12、uperhelical turnHistone H1 * * 组蛋白组蛋白H1H1把核小体把核小体 “封锁封锁”起来起来连接连接 DNADNA 100 bp平均平均 55 bpNucleosomeHistone H1Nucleosome repeat:Core + linker DNA200 bp 、染色体结构的形成、染色体结构的形成 （1 1） 首先若干个核小体形成念珠状结构首先若干个核小体形成念珠状结构 The 10 nm fiber is a continuous strong of nucleosomes.每个核小体单位包括：200bp左右的DNA、一个组蛋白八聚体、一分子H1 高度有

13、序高度有序 左手螺旋左手螺旋 每圈包括六个核小体每圈包括六个核小体 30 nm fiber(直径直径30nm)Solenoid (螺线管）螺线管）（2 2） 30nm30nm纤丝纤丝的构成的构成 染色质结构的第二层次染色质结构的第二层次a a、组成、组成核小体串珠纤维在酶的作用下形成每圈6个核小体，外径30nm的螺旋结构。 Nuclear matrix (核基质核基质) ), protein complex30 nm fiber300 nmb b、体内存在状态、体内存在状态从从DNA到染到染色体的过程色体的过程Compaction ratio = 8000螺旋结构再次螺旋化，形成超螺旋结构（此

14、处有争议，人卫版医学细胞生物学同意超螺旋学说，而北大版教材认为3级结构是微带，即曲折化的螺线管），此为3级结构 （3）真核生物基因组结构特点真核基因组结构庞大 3109bp、染色质、核膜单顺反子基因不连续性 断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、 外显子(exon)非编码区较多 多于编码序列(9:1) 含有大量重复序列 不重复序列/单一序列：在基因组中有一个或几个拷贝。真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。如：蛋清蛋白、血红蛋白等 功能：主要是编码蛋白质。 中度重复序列：在基因组中的拷贝数为101104。 如：rRNA、tRNA 一般是不编码蛋白质的序列，

15、在调控基因表达中起重要作用 高度重复序列：拷贝数达到几百个到几百万个。 卫星DNA：A T含量很高的简单高度重复序列。第二节第二节 DNA的复制的复制DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制一、核酸生物合成的一般规律一、核酸生物合成的一般规律 绝大多数DNA和RNA的生物合成均按照Watson-Crick的碱基配对原则，以预先存在的DNA链为模板，逐个复制，生成新的拷贝。某些病毒以RNA为模板，以逆转录方式合成互补的DNA（cDNA），然后再合成病毒RNA。 DNA或RNA链的生物合成只能以5-3方向进行。 特异性的聚合酶类催化核酸的生物合成：DNA聚合酶以DNA为模板催化DNA生物合成

16、，称为复制；RNA聚合酶以DNA为模板，催化RNA的生物合成，称为转录。而逆转录酶以RNA为模板，合成DNA。在复制过程中，双螺旋在复制过程中，双螺旋DNA的两条链都作为模板，的两条链都作为模板，分别合成两条分别合成两条DNA子链。在转录过程中，双螺旋子链。在转录过程中，双螺旋DNA中只有一条链为模板，中只有一条链为模板，RNA聚合酶合成与模聚合酶合成与模板互补的板互补的RNA链。链。 RNA聚合酶进行聚合反应时，能够直接以NTP为底物，逐个聚合，即从头合成RNA。但DNA聚合聚合酶不能催化从头开始合成酶不能催化从头开始合成DNA，必须具有引物，必须具有引物，底物dNTP只能加到已存在的RNA

17、或DNA链的3OH末端。二、二、基基 本本 概概 念念 ( Basic Concept ) DNA复制复制 亲代双链亲代双链DNADNA分子在分子在DNADNA聚合酶的作用下，分别以聚合酶的作用下，分别以 各单链各单链 DNADNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补分子为模板，聚合与自身碱基可以互补 配对的游离的配对的游离的dNTP,dNTP, 合成出两条与亲代合成出两条与亲代DNADNA分子完分子完 全相同的子代全相同的子代DNADNA分子的过程。分子的过程。 复制子复制子（RepliconReplicon）；又称）；又称复制单位复制单位 或复制元或复制元DNA中含有一定复制起点和复制终点的

18、复制单位中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。 1.3万万 90万不等万不等 复制体复制体 （Replisome） The multi protein (30 The multi protein (30) structure that ) structure that assembles at replicating fork to undertake assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA synthesis of DNA 复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成

19、动作合成DNA 复制叉复制叉DNA复制时，首先在一定位置解开双链，这个复制起复制时，首先在一定位置解开双链，这个复制起点呈现叉子的形式，称为复制叉。点呈现叉子的形式，称为复制叉。三、三、DNA的半保留复制的半保留复制（Semi-Conservation Replication） 概念：概念： 复制过程中各以双螺旋复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模的其中一条链为模 板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子 代代DNA分子。分子。 全保留复制全保留复制半保留复制半保留复制混合复制混合复制1958 Meselson-stahl 设计的设计的CsCl超离

20、心试验证实了超离心试验证实了DNA复制的这一特性。复制的这一特性。 DNA半保留复制的实验依据：半保留复制的实验依据： 1958年年 Meselson & Stahl E.coli 放射性同位素（放射性同位素（15N）标记）标记 CsCl密度梯度离心密度梯度离心StahlMeselson培养一代培养一代培养二代培养二代培养三代培养三代15N 标记实验标记实验 细胞生长在细胞生长在15N 标记培养基中标记培养基中 转入正常转入正常N源培养基中源培养基中 分离各代分离各代DNA 分析各代分析各代DNA的浮力密度的浮力密度15N 标记标记 DNA未标记未标记 DNA CsCL密度梯度离心密度

21、梯度离心 浮力密度浮力密度 N15DNA 1.742g/ml N15N14DNA 1.717g/ml N14DNA 1.710g/ml DNA半保留复制的半保留复制的意义：保证意义：保证DNA代谢的稳代谢的稳定性。定性。 经过多代的复制，经过多代的复制，亲代的遗传特征完整无误的亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，传递给子代，子代子代DNA仍可以保持与最初亲本仍可以保持与最初亲本的一致性。的一致性。 稳定性是相对的，变异是绝对的稳定性是相对的，变异是绝对的在各种理化因素的作用下，在各种理化因素的作用下，DNA会发生损伤；会发生损伤；在复制、转录的过程中，在复制、转录的过程中，DNA会发生错误；会

22、发生错误；在生长发育的过程中，在生长发育的过程中，DNA可能进行修饰、删可能进行修饰、删除、扩增和重排。除、扩增和重排。 四、复制起点、方式和方向四、复制起点、方式和方向1、复制起点（、复制起点（origin ori或或 o 复制原点）复制原点） 复制开始处复制开始处DNA分子的特定位置分子的特定位置原核生物（原核生物（Prokaryote）：单复制起点）：单复制起点 即即整个染色体整个染色体只有一个复制单位只有一个复制单位 真核生物（真核生物（Eukaryote） : 多复制起点多复制起点 即即一个一个genome中有中有多个复制单位多个复制单位Replication fork 复制叉（复制

23、叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点即复制正在发生的位点 2、复制方向（复制过程的顺序性）、复制方向（复制过程的顺序性） 复制眼（复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的）：电子显微镜下观察正在复制的DNA， 复制的区域形如一只眼睛复制的区域形如一只眼睛真核生物的多复制子真核生物的多复制子 多个复制眼多个复制眼 （1） 单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉 单向复制单向复制 双向复制双向复制（2） 复制方向的多模式复制方向的多模式 单单

24、起点、起点、单单方向方向（原核）（原核）多多起点、起点、单单方向方向（真核）（真核）单单起点、起点、双双方向（原核）方向（原核）多多起点、起点、双双方向（真核）方向（真核） 3、复制方式、复制方式大多数以对称方式进行即两条链同时复制大多数以对称方式进行即两条链同时复制也有一定时期内也有一定时期内DNA只复制一条链的情况只复制一条链的情况 （1） 从新起始（从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式）或复制叉式 （ replication fork ） 比较形象的比较形象的 复制复制 双链环状双链环状DNADNA的复制眼可以形成一种的复制眼可以形成一种结构，形状像结构，形状像

25、 希腊字母希腊字母，因而叫，因而叫. A replication eye forms a theta structure in circular DNA.两个共价封闭两个共价封闭的互相盘绕的的互相盘绕的DNA双链在拓双链在拓扑异构酶作用扑异构酶作用下从起始点下从起始点（ori）开始形）开始形成成DNA切口和切口和封闭，封闭，DNA的的一条或两条主一条或两条主链骨架有暂时链骨架有暂时的切断，是的切断，是DNA超旋或解超旋或解旋，有利于复旋，有利于复制叉向前移动。制叉向前移动。 （2） 置换式置换式 （Displacement form ） 又称又称 D 环复制环复制 线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体

26、 DNA的复制方式的复制方式2/3属于不对称的复属于不对称的复制方式，双链制方式，双链DNA的两条链分的两条链分别有自己的别有自己的ori。（3）共价延伸方式（）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复）或滚环式复 制（制（rolling circle replication） 由于复制时产生的滚环结由于复制时产生的滚环结 构形状象构形状象，又称，又称复制复制 病毒、细菌因子和真核生物病毒、细菌因子和真核生物 第三节第三节 原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNA的的复制特点复制特点一、原核生物一、原核生物DNA的复制特点的复制特点1、DNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋

27、DNA解螺旋酶或解螺旋酶或DNA解链酶解链酶大肠杆菌的解螺旋酶、与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。解螺旋酶I、II、III沿着模板链的53方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿35方向移动。 解旋酶解旋酶(helicase): 使使DNA的两条链分开，它通常利用的两条链分开，它通常利用ATP水解来提供必需的能量；水解来提供必需的能量； 该酶能使复制叉前方的该酶能使复制叉前方的DNA双链解开一短双链解开一短段，每解开一个碱基对需要两分子段，每解开一个碱基对需要两分子ATP水水解成解成ADP和和Pi以供给能量。一旦有一段碱以供给能量。一旦有一段碱基顺序解开，就会有几个

28、分子的单链结合基顺序解开，就会有几个分子的单链结合蛋白（蛋白（SSB）与每条分开的）与每条分开的DNA链紧密结链紧密结合，以防止它们重新接触结合碱基对。合，以防止它们重新接触结合碱基对。 DNA旋转酶旋转酶 属DNA拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生物和真核生物。 拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。 拓扑异构酶使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（

29、SSB） 复制叉上的解螺旋酶，沿双链复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生前进，产生单链区，大量的单链单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。不被核酸酶降解。原核生物原核生物SSB蛋白与蛋白与DNA结合表现为协同效应，如结合表现为协同效应，如第一个第一个SSB蛋白结合到蛋白结合到DNA上的能力为上的能力为1，第二，第二个个SSB结合能力高达结合能力高达1000倍，真核生物倍，真核生物SSB蛋白蛋白无协同效应。无协同效应。 单链结合蛋白（单链结合蛋白（single-strand binding protei

30、n):单链单链DNA结合，阻止其再形成双链体状态结合，阻止其再形成双链体状态X174 噬菌体的噬菌体的DNA在在三种功能蛋白先后作用下三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：分开成为单链：在复制起始点，在复制起始点，噬菌体噬菌体A蛋白蛋白使病毒（使病毒（+）链产生）链产生缺口。缺口。Rep蛋白蛋白提供解旋提供解旋酶活性，它使两链分离。酶活性，它使两链分离。SSB包绕单链形成稳定包绕单链形成稳定的单链形式。的单链形式。Three proteins unwind X174 DNA 在复制叉处，在复制叉处，DNADNA的两条链都作为模板同时合成两条新链。的两条链都作为模板同时合成两条新链。DNADNA分

31、子的两条链是反向平行的，而分子的两条链是反向平行的，而DNADNA复制时无论以那条链复制时无论以那条链做模板，新合成的链是按做模板，新合成的链是按5 533方向进行的，所以只有一条模方向进行的，所以只有一条模板链指导合成的新生链能够沿着复制叉运动的方向连续复制，板链指导合成的新生链能够沿着复制叉运动的方向连续复制，此新合成的链称为前导链（此新合成的链称为前导链（leading strandleading strand）。另一条模板）。另一条模板链指导合成的新生链也是沿链指导合成的新生链也是沿5 533方向进行，但与复制叉前进方向进行，但与复制叉前进的方向相反，是分段合成的，这些片断于的方向相反

32、，是分段合成的，这些片断于19691969年首先在大肠年首先在大肠杆菌中分离出来，被称为冈崎片段。杆菌中分离出来，被称为冈崎片段。 2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性 （Semi-Discontinuous Replication） 迄今发现的迄今发现的DNA聚合酶只能催化聚合酶只能催化DNA链从链从5端端向向3端延长。端延长。在细菌中冈崎片段长约在细菌中冈崎片段长约100010002000 2000 核苷酸，但在真核生物核苷酸，但在真核生物中，相应片断的长度可能短得多，由中，相应片断的长度可能短得多，由100100400400个核苷酸组个核苷酸组成。合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片

33、段以后由成。合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由DNADNA连连接酶连成完整的接酶连成完整的DNADNA链，因此冈崎片段是链，因此冈崎片段是DNADNA复制中短暂的复制中短暂的中间产物。这条链不连续合成的链称为滞后链中间产物。这条链不连续合成的链称为滞后链(lagging (lagging strand) strand) 。这种前导链的连续复制和滞后链的不连这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是普遍存在的，称为续复制在生物界是普遍存在的，称为DNADNA合成的半合成的半不连续复制。不连续复制。 One strand replicated as continuous segme

34、nt先导链按先导链按 dUMP dUMP 片段连续复制片段连续复制后随链按后随链按Okazaki 片段不连续复制片段不连续复制 先导链（先导链（leading strand）：）：DNA复制时，与复制叉向复制时，与复制叉向 前移动的方向一致，以前移动的方向一致，以35链为模板，按链为模板，按 53方向连续合成的一条链方向连续合成的一条链 后随链（后随链（lagging strand）：）：冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment): DNA复制不连续合成复制不连续合成 链中形成的短链中形成的短DNA片段片段3 DNA复制的引发和终止复制的引发和终止 在细胞提取物中合成冈崎片段时，不仅

35、需要dNTP作为前体，还需要一个与模板DNA碱基顺序互补的RNA短片段作为引物。 DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3端开始合成新的DNA链。 对于前导链，引发过程引发过程很简单，只要一段引物，DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去。但对于滞后链，引发过程很复杂，需要多种蛋白质和酶的协同作用，还涉及冈琦片段的形成和连接。复制叉的结构及参与复制的酶与因子复制叉的结构及参与复制的酶与因子 对于链的终止不需要特定的信号，大肠杆菌的两个复制叉进行双向复制，会合点就是复制终止点，一般位于oriC的相对处（大肠杆菌DNA中分离的一个245bp的

36、片段，能支持任何DNA分子在大肠杆菌细胞内复制的最小片段，该245bp的片段称为oriC）。正向重复序列正向重复序列反向重复序列反向重复序列4 DNA聚合酶聚合酶 一旦复制起始，复制叉就沿着一旦复制起始，复制叉就沿着DNA分子前进，合成与亲本分子前进，合成与亲本链互补的两条新链互补的两条新DNA链。新生链的合成由链。新生链的合成由DNA聚合酶催聚合酶催化完成化完成。从大肠杆菌细胞中分离出了。从大肠杆菌细胞中分离出了5种种DNA聚合酶。聚合酶。DNA聚合酶聚合酶III是大肠杆菌是大肠杆菌DNA复制中链延伸反应的主要聚复制中链延伸反应的主要聚合酶。合酶。DNA聚合酶聚合酶I专门用于专门用于RNA引

37、物的去处。另外引物的去处。另外3种种DNA聚合酶主要参与聚合酶主要参与DNA修复和跨损伤合成。修复和跨损伤合成。（1 1）DNADNA聚合酶聚合酶I I DNA pol I DNA pol I由一条多肽链组成，分子量为由一条多肽链组成，分子量为109 KD109 KD。酶分子中含有一个酶分子中含有一个ZnZn2 2，是聚合酶活性必需的。用枯，是聚合酶活性必需的。用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个片段，大片段的分草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个片段，大片段的分子量为子量为68 KD68 KD，通常称为，通常称为klenowklenow片段，小片段为片段，小片段为35KD35KD。大小片段具有不同的

38、酶活性。大小片段具有不同的酶活性。1. easily cleaved into two fragments by proteinase:a. large fragment (Klenow fragment) contains polymerase and 3-5 exonuclease (proofreading domain). Used in vitro for synthesis reactions (DNA sequencing). E. coli DNA pol I (polA)NCC（a a）DNADNA聚合酶的聚合酶的5353聚合活性聚合活性 这是这是DNADNA聚合酶最主要的活

39、性，按模板聚合酶最主要的活性，按模板DNADNA上的核上的核苷酸顺序，将互补的苷酸顺序，将互补的dNTPdNTP逐个加到引物逐个加到引物RNA3RNA3-OH-OH末末端，即促进端，即促进3-OH3-OH与与dNTPdNTP的的5-PO5-PO4 4形成磷酸二酯键，形成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的酶的专一性表现为新进入的dNTPdNTP必须与模板必须与模板DNADNA碱碱基配对时才有催化作用，基配对时才有催化作用，5353聚合活性存在于聚合活性存在于klenowklenow片段上片段上。 DNADNA聚合酶聚合酶I I的延伸能力不强，每的延伸能力不强，每次与模板引物结合仅能添加次与模板

40、引物结合仅能添加2020100100个核苷酸。个核苷酸。 （b b）DNADNA聚合酶的聚合酶的3 355外切核酸酶外切核酸酶（exonuclease)exonuclease)活性活性 这种酶活性的主要功能是从这种酶活性的主要功能是从3 3 5 5方向识别并切方向识别并切除除DNADNA生长链末端与模板生长链末端与模板DNADNA不配对的核苷酸，这种不配对的核苷酸，这种功能称为校对功能（功能称为校对功能（proofreadingproofreading），这是保证其），这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于维持聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于维持DNADNA复制的真实性（复制的真实

41、性（replicational fidelityreplicational fidelity）至关重）至关重要。要。 Proofreading by DNA polymerase(c)DNA(c)DNA聚合酶的聚合酶的5353外切核酸酶活性外切核酸酶活性 这种酶活性是从这种酶活性是从DNADNA链的链的5 5端向端向3 3末端水解已配对的核苷酸，末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除本质是切断磷酸二酯键，每次能切除1010个核苷酸。因此，这种个核苷酸。因此，这种酶活性在酶活性在DNADNA损伤的修复中可能起重要作用，损伤的修复中可能起重要作用，对完成的对完成的DNADNA片段

42、片段去除去除5 5端的端的RNARNA引物也是必须的引物也是必须的。 在双链在双链DNADNA的单链缺口上，的单链缺口上，DNA polDNA pol的的5 533聚合活性和聚合活性和5 533外切酶活性同时发生，就好像一个外切酶活性同时发生，就好像一个5 5-P-P端的核苷酸在移动，端的核苷酸在移动，缺口在移动。进行中的新链聚合置换原来的链，这种反应叫做缺口在移动。进行中的新链聚合置换原来的链，这种反应叫做缺口平移缺口平移(nick translation) (nick translation) (2) DNA Polymerase III (DNA聚合酶聚合酶 III） DNADNA聚合酶

43、聚合酶IIIIII由由1010个不同的亚基构成。其中个不同的亚基构成。其中、和和亚基构成核心酶。亚基构成核心酶。亚基具有亚基具有5 533 聚合酶活聚合酶活性，性，亚基具有亚基具有3 355外切活性外切活性，亚基功能尚不清亚基功能尚不清楚，可能仅仅起结构上的作用，使两个核心亚基以及楚，可能仅仅起结构上的作用，使两个核心亚基以及其他各辅助亚基装备在一起，因此起其他各辅助亚基装备在一起，因此起组装作用组装作用。DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII由两个亚单位组成，形成不对称的二聚体由两个亚单位组成，形成不对称的二聚体。 (Note: no beta subunits are shown; with

44、out beta, this form of the complex is called DNA pol III*)组成核组成核心聚合心聚合酶，形酶，形成催化成催化DNA合合成的活成的活动中心。动中心。性性 质质聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶II聚合酶聚合酶III35外切外切+5 3外切外切+-新生链的合成新生链的合成-+生物学活性生物学活性10.0515生物学功能生物学功能切除引物切除引物修复修复DNA修复修复DNA复复 制制大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I、II、 III 的性质比较的性质比较 5、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷

45、酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNADNA连接酶连接酶在在DNADNA复制、损伤修复、重组等过程复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。中起重要作用。3535OHOHP P 6、复制忠实性的保证、复制忠实性的保证 1、DNApol的的35外切酶活性外切酶活性 (exonuclease activity) 2、DNApol只能从引物的只能从引物的3 端延伸端延伸DNA （需要需要RNA引物引物） a、碱基配对协同性导致最初几个碱基错配率高，、碱基配对协同性导致最初几个碱基错配率高， 且不易校正（原因：且不易校正（原因：从模板复制

46、最初几个核酸时，碱基从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配堆集力和氢键都较弱，易发生错配 ） b、RNA引物最终被降解而避免错误引物最终被降解而避免错误 3、后随链的不连续合成、后随链的不连续合成 因其有利于错配碱基的校正。因其有利于错配碱基的校正。二、二、真核生物真核生物DNA的复制特点的复制特点(DNA replication in Eukaryote) 1、 复制概况复制概况 a、多个复制元（、多个复制元（multiple replicon ），双向复制），双向复制 b、复制元相对较小、复制元相对较小(13-900kb), 复制速度较慢复制速度较慢,大大 约约 50

47、05000bp/min （3000bp/min） c、复制终止通过复制、复制终止通过复制 叉的相遇而终止叉的相遇而终止 multiple replicon 例；果蝇例；果蝇 5000 replicons replicons 平均平均 40Kb40Kb（酵母）（酵母） 哺乳动物哺乳动物 平均平均100Kb100Kb 2、 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 、五种五种 位置位置 核内核内 核内核内 核内核内 核内核内 线粒体线粒体 合成合成 与与引发引发 修复修复 合成合成 合成合成,修复修复 复制复制功能功能 酶酶结合结合 前导链前导链 后随链后随链35校校 NO NO Yes Yes Y

48、es正活性正活性 真核生物真核生物DNADNA复制的引发酶复制的引发酶 DNApol + primaseDNApol + primase形成紧密的复合物形成紧密的复合物 6-9 Nt RNA as primer 引发酶（引发酶（primase）：）： 50-60kd 作用方式为阵发性的，每次作用拷贝作用方式为阵发性的，每次作用拷贝615个核苷酸个核苷酸 SV40体外体外DNA复制情况分析复制情况分析 3.真核生物染色体在全部复制完成之前，各个复制起始点不能开始新一轮复制。原核生物中复制起始点上连续开始新的复制事件，表现为一个复制子内套叠有多个复制叉。4.真核生物真核生物DNA的复制起始点被称为

49、自主复制序列的复制起始点被称为自主复制序列（ARS），长约为），长约为150bp左右，含有几个复制起左右，含有几个复制起始必需的保守区。并且复制起始需起点识别复合始必需的保守区。并且复制起始需起点识别复合物（物（ORC）参与，并需要）参与，并需要ATP。5. 端粒的复制。线性染色体的末端端粒的复制。线性染色体的末端DNA称为端粒，称为端粒，端粒的功能主要是稳定染色体末端结构，防止染端粒的功能主要是稳定染色体末端结构，防止染色体之间的末端连接。复制由一种特殊的酶色体之间的末端连接。复制由一种特殊的酶端粒酶所催化。端粒酶所催化。a、复制子的大小（、复制子的大小（Sizes of replicon）

50、:Yeast or fly平均平均 40 kbMammals 平均平均 100 kbProkaryotic DNA: 1000 kbb、冈崎片段、冈崎片段(Okazaki fragments):Prokaryotic DNA:1000-2000 ntEukaryotic DNA:100-200 ntc、复制速度（、复制速度（Rate of replication）:Eukaryotic DNA:ca. 3,000bp/min (50/sec)Prokaryotic DNA:50,000bp/min (900/sec)原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNADNA复制的比较复制的比较 1. S

51、emi-conservative replication2. Semi-discontinuous repliction3. DNA helicase, Ssb4. RNA priming5. 校正阅读（校正阅读（Proofreading）1. 复制起点（单、多）2. 复制子（大小、多少）3. 复制起始的许可因子的控制 （复制周期的重叠与否）4. 复制叉移动的速度 (900/50 nt/S)5. 冈崎片段的大小6. 端粒和端粒酶7. DNA聚合酶Polymerases相同点：不同点：三三 DNA复制的调控复制的调控 1 大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNA的复制调控的复制调控染色体的复制与细胞分裂同步，复制的起始不依赖染色体的复制与细胞分裂同步，复制的起始不依赖于细胞分裂，但复制的终止则能引发细胞分裂