转染技术原理及应用

1、常规转染技术分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染永久转染。前者 外源DNA/RN 哥整合到宿主染色体中， 因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数， 产生高 水平的表达，但通常只持续几天，多用丁启动子和其它调控元件的分析。 一般来说，超 螺旋质粒 DNA 专染效率较高，在转染后 24-72 小时内依赖丁各种不同的构建分析结 果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，6 半乳糖苜酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源 DN 截可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体episome存在。 尽管线性 DN/匕超螺旋 DNA 专入量低但整合率高。 外源 DNAS 合到染色体中概率很小，大约1/104转染

2、细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶APH 新霉素抗性基因 ，潮霉素 B 磷酸转移酶HPH ,胸苜激酶TK等反复筛选，得到 稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化 DNM 转染试剂比例， 细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如 DEAW 旋糖苜法，磷酸钙法, 电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：转染方法原理应用特点磷酸钙法磷酸钙 DNAM 合物吸附 ，田胞膜被细胞内吞稳定转染 瞬时性转染不适用丁原代细胞 操作简便但重复性差 有些细胞不适用DEAE 右旋糖甘法带正电的 DEAE 右旋糖 昔与核酸带负电的磷

3、酸 骨架相互作用形成的复 合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的蠹副作用转染时需除血活电穿孔法脉冲电压破坏细胞膜 电位，DNA!过膜上形成稳定转染瞬时性转染所有细胞适用性广但细胞致死率高， DNAffi 细胞用量大，需根据不同细胞类 型优化电穿孔实验条件病毋介导法通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染可用丁难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等逆转录病毋特定宿主细胞但携市基因不能太大细胞需处分契苴日需考虑平安因素腺病毋、过侵染宿主细胞将外 基因整合到染色体中瞬时转染 特定宿主细胞可用丁难转染的细胞 需考虑平安因素一、一， 一 阳离旨质体电的脂质体与核酸 “负电的磷酸

4、基团形成 k 合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染所有细胞适用性 J ,转染效率局， 重复性好，但转染时需除血活。转染效果随细 胞类型变化大Biolistic 颗粒传递法将 DNAffl 显微重金届颗 沉淀，再将包被好的 叫粒用弹道装置投射入 细胞，DNAS 胞内逐步释 ,表达瞬时性转染可用丁： 人的表皮细胞， 纤维原细 胞，淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法用显微操作将 DNAft 接入靶细胞核稳定转染 瞬时性转染转染细胞数有限， 多用丁工程改造 或转基因动物的胚胎细胞各种转染方法的比拟除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞蠹性小，转

5、染效率高受到研究者们的宵睐。其中 树枝 状聚合物Dendrimers 和聚乙烯业胺Polyethylenimine , PEI的转染性能最正确， 但树枝状聚合物的结构不易丁进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯业胺是一种具有 较高的阳离子电荷密度的有机大分子， 每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质 子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何 pH 下都能充当有效的“质子海绵 proton sponge体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种届细胞，其效果好丁脂质聚酰 胺，经进一步的改性后，其转染性能好丁树枝状聚合物，而且它的细胞蠹性低。大量实验证明，PEI 是非常有希望的基因治疗载体。目前在

6、设计更复杂的基因载体时，PEI 经常做为核心组成成分。线型 PEILine PEI,LPEI 与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状 PEIBranchedPEI,BPEI要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA 转染复合物的细胞蠹性较低， 有利丁细胞定位， 因此与 BPEI 相比应该转染效率高一些。 但最近研究表 明 BPEI的分枝度高有利丁形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞蠹性 也增大。超高分枝的、较柔性的 PEI 衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基， 在染实验中发 现这种 PEI 的蠹性低，但转染效率却较高。GenEscort 是采用各种分枝状和超高分枝状的

7、小分子 PEI 与各种含有生理条件下可降解 键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的 PEI 衍生物。聚合物的分枝结构使 得其具有较高的正电性，因此易丁高效地包裹各种 DNA RNM 子及质粒形成小的纳米 颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降 解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞蠹性的小分子 PEI,这样结构的 转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞蠹性，其可降解性对体内应用也 具有重要的意义。影响转染实验的因素转染技术是指将外源分子如 DNA RN 酣导入真核细胞的技术。随着分子生物 学和细胞生物学研究的不断开展，转染已经成

8、为研究和控制真核细胞基因功能的 常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试 验中，其应用越来越广泛。影响转染效率的因素有很多，细胞株本身的特性和活 性，细胞培养条件，转染的 DNARNA 勺质量，转染方法，转染试剂的选择等。 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染永久转染。 前者外源 DNA/RN 际整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝 数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用丁启动子和其它调控元件的分 析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 专染效率较高，在转染后 24-72 小时内依赖丁 各种不同的构建分析结果，常常用到一些报告系

9、统如荧光蛋白，6 -半乳糖苜酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源 DNAS 可以整合到宿主染色体中， 也可能作为一种游离体episome存在。尽管线性 DNA超螺旋 DNA 专入量低 但整合率高。外源DN 曜合到染色体中概率很小，大约 1/104 转染细胞能整合， 通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶 APH 新霉素抗性基因， 潮霉素 B 磷酸转移酶HPH ,胸苜激酶TK等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个：1. 转染试剂不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在 转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染

10、试剂。每种转染试剂都会 提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设 计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低蠹、方便、廉价的转染试剂。2. 细胞状态一般低的细胞代数(50)能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传 代后到达指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。细胞培养在实验室中 保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。 这会导 致和转染相关的细胞行为的变化。也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同 培养条件下，其生物学性状发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。因此，如果发现转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最正确

11、结果。3. 转染方法不同转染试剂有不同的转染方法，但大多大同小异。转染时应跟据具体转染试剂 推荐的方法，但也要注意，因不同实验室培养的细胞性质不同，质粒定量差异， 操作手法上的差异等，其转染效果可能不同，应根据实验室的具体条件来确定最 佳转染条件。(1) 细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的根底。不同细胞有不同的培养基，血活和添加物。 高的转染效率需要一定的细胞密度， 一般的转染试剂都会有专门的说明。 推荐在 转染前 24小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源 DNAfg 入的可能。 一定要防止细菌，支原体或真菌的污染。(2) 细胞密度细胞密度对转染效率有一定的影响。 不同的转染试剂，

12、要求转染时的最适细胞密 度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高 或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新 的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳 定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。 阳离子脂质体具有微量的细胞蠹性 而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞90%匚片；而有些多胺或者非脂质体的配方那么要求在 40%-80 咆问，总之是尽量在细胞最适的 生理状态下转染，以求最正确的转染效果。不同的实验目的也会影响转染时的铺板 密度，比方研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较

13、低的铺板密度， 所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。一般转染时贴壁细胞密度为 50%-90%但这个需要参考所选转染试剂的说明书。(3) 血活血活一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞 或者在无血活培养基条件下转染，但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损 伤，甚至死亡导致转染效率极低。不过转染产品配方几经革新后的今天， 对丁主 流的转染试剂来说，血活的存在已经不会影响转染效率， 甚至还有助丁提高转染 效率，如阳离子聚合物等，血活的存在会影响 DNA-转染复合物的形成，但只要 在 DNA 转染复合物形成时用无血活培养基或 PBS 来稀释 DNAK 转染试剂就

14、可以了，在转染过程中是可以使用血活的。不过要特别注意：对丁RNA 专染,如何消除血活中潜在的 RNase 亏染是值得关注的。胎牛血活FCS 经常用到，廉价一 点的有马或牛血活。通常的，血活是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切 成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差异。 血活质量的变化直接影响 细胞生长，因此也会影响转染效率。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。4抗生素细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染，但是这些添加剂可能对转染造成 麻烦。比方宵霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。 这些抗生素一般对 丁真核细胞无蠹，但有些转染试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。

15、这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。目前转染试剂因为全程都可以用有 血活和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，非常方便，省去了污染等麻烦。5氮磷N/P比N/P 比是转染效率的关键为了换算方便，一般以 DNA 转染试剂质量比表示， 在一定比例范围内转染效率随 N/P 比成比例增高，之后到达平值，但蠹性也随之 而增加，因此在实验之前应根据推荐比例，确定本实验的最正确转染比例。6DNA量DNA量对转染效率影响非常大。一般的转染技术如脂质体等基丁电荷吸引 原理，如果 DNM 纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染 复合物的有效形成及转染的进行，但对 GenEscort 系歹 0 转染

16、试剂影响不大。核酸 纯化世界第一品牌德国QIAGEN司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能到达两倍 2X CsCl 梯度离心以上的纯度效果，使您不必为 DN 破量操心。此外，对一些内 蠹素敏感的细胞如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞，QIAGEN3S 提供可去除内蠹素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子， 保证理 想的转染效果。但如果使用 GenEscort 转染试剂，一般不需要这么高的 DN 破量 要求。当使用GenEscort 转染试剂时，即使采用传统的酚一氯仿沉淀方法纯化质 粒，仍然可到达非常好的转染效果，但所用的质粒量比试剂盒纯化方法的DNA用量大一些。4.载体构建转染载体的构

17、建病蠹载体，质粒 DNA RNA PCRT 物，寡核苜酸等也影响转 染结果。病蠹载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病蠹载体有其特定的宿 主，有的还要求特定的细胞周期， 如逆转录病蠹需侵染分裂期的宿主细胞，此外 还需考虑一些平安问题 如基因污染。除载体构建外，载体的形态及大小对转 染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性 DNAM 瞬时和稳定转染的影 响。如果基因产物对细胞有蠹性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控， 强度适宜的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正 对照可排除蠹性影响的干扰。转染技术的要点及转染试剂正确选择转染技术的要点及转染试剂正确选择转

18、染技术是指将外源分子如 DNA RN 酣导入真核细胞的技术，它是研究基因表 达调控，突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。以 下就向大家介绍一些转染的技术要点及市面上主要的转染试剂类型的选择。常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染永久转染。前者外源 DNA/RN 际整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝 数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用丁启动子和其它调控元件的分 析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 专染效率较高，在转染后 24-96 小时内依赖丁 各种不同的构建分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，6 半乳糖苜酶等来帮助检测。

19、后者也称稳定转染，外源 DNA可以整合到宿主染色体中，也 可能作为一种游离体episome存在。尽管线性 DNAt 超螺旋 DNA 专入量低但 整合率高。外源 DN曜合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通 常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶 APH 新霉素抗性基因，潮 霉素 B 磷酸转移酶HPH ,胸苜激酶TK等反复筛选，得到稳定转染的同源 细胞系。转染效率收多种因素影响，主要因素有下面几个：1. 细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的根底。不同细胞有不同的培养基，血活和添加物。 低的细胞代数50能确保基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度， 一般的转染试剂都会有

20、专门的说明。推荐在转染前 24 小时分细胞，这将提供正 常细胞代谢，增加对外源 DN 斓入的可能。一定要防止细菌，支原体或真菌的污 染。2. 血活大多数培养基在使用前需要加血活。胎牛血活FCS 经常用到，廉价一点的有 马或牛血活。通常的，血活是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的 添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差异。 血活质量的变化直接影响转染效 率。因此在转染前建议先测转右试出对细胞生长良好的血活批号，转染时用同 一批号的血活，并同时做负对照不加转染试剂及外源DNA 以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血活存在情况下效率很低，因此在转染前要除血活。但有些对此敏感

21、的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染 效率极低。3. 载体构建转染载体的构建病蠹载体，质粒 DNA RNA PCRT 物，寡核苜酸等也影响转 染结果。病蠹载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病蠹载体有其特定的宿 主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病蠹需侵染分裂期的宿主细胞， 此外 还需考虑一些平安问题如基因污染。除载体构建外，载体的形态及大小对转 染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性 DNAM 瞬时和稳定转染的影 响。如果基因产物对细胞有蠹性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控， 强度适宜的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正 对照可排除蠹性影响的干扰。4. DNA 质量DN 触量对转染效率影响非常大。一般的转染技术如脂质体等基丁电荷吸引 原理，如果 DNM 纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染 复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN司提供的超纯质粒抽提试剂盒， 能到达两倍 2x CsCl 梯度离心以上的纯度效果， 使您不 必为 DNAW量操心。此外，对一些内蠹素敏感的细胞如原代细胞，悬浮细胞和 造血细胞，QIAGENS提供可去除内蠹素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提 过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。5.转染技术转染技术的选择对