基因工程实验PPT课件

1、基本原理基本原理DNA提取提取DNA纯化纯化操作步骤操作步骤注意事项注意事项脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA)(RNA) 与蛋白质结合在一起以与蛋白质结合在一起以 核蛋白（核蛋白（DNPDNP）的形式存在。）的形式存在。在制备核酸时通常在制备核酸时通常 破坏细胞壁及细胞膜来使破坏细胞壁及细胞膜来使 核蛋白释放出来。核蛋白释放出来。核酸的理化性质核酸的理化性质uDNADNA为白色类似石棉样的为白色类似石棉样的纤维状物，纤维状物，RNARNA的的纯品呈纯品呈白色粉末或结晶白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都。核酸和核苷酸大都呈酸味。呈酸味。uDNADNA、RNA

2、RNA和核苷酸都是和核苷酸都是极性化合物极性化合物，一，一 般都般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶 剂，剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水它们的钠盐比游离酸易溶于水。u在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。性溶液中较稳定。SDSSDS法法 SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸裂解核酸-蛋白复合物。在较高温

3、度下，破坏蛋白质蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与与DNA的结合，使的结合，使DNA释放出来。释放出来。SDS是有效的阴是有效的阴离子去垢剂，细胞中离子去垢剂，细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。能够破坏这种价键。十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠CTAB：十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜与脂膜，可溶解细胞膜与脂膜，使细胞中的使细胞中的DNA-蛋白质复合物释蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。它能

4、与它能与核酸形成复合物。核酸形成复合物。 在高盐溶液中在高盐溶液中(0.7molL NaCl)是可溶的，当降低溶是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度液盐浓度到一定程度(0.3molL NaCl)时，从溶液中沉淀，时，从溶液中沉淀，通过离心就可将通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇随之能溶解于乙醇随之被除去。被除去。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离。Tris-HCl

5、(pH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。NaCl 提供一个高盐环境，使CTAB与核酸形成的复合物充分溶解，存在于液相中。EDTA(乙二胺四乙酸)螯合Mg2+ 或Mn2+ ，抑制DNase活性。- 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，PVP-K30（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化，使酚容易去除。CTAB提取缓冲液中各试剂的作用：提取缓冲液中各试剂的作用：聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮,是一种非离子型高分子化合物是一种非离子型高分子化合物6. 加入 1/10 体积的醋酸钠，2 倍体积的无水乙醇，充分混匀，4冰箱中静置20min。7. 10000rpm 离心 10m

6、in，弃上清。8. 分别用 75%酒精和无水乙醇漂洗沉淀 2 次，倒掉酒精，将离心管管口朝下，自然晾干。9. 加入 100l 1TE 溶液溶解 DNA，也可以 50助溶，保存在 4备用。3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。Total DNA extraction from eukaryotic tissue表面活性剂，能溶解细胞膜表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使D

7、NA得以得以游离出来）。游离出来）。再加入氯仿等再加入氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸核酸(DNA(DNA、RNA)RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入乙醇使乙醇使DNADNA沉淀，沉淀沉淀，沉淀DNADNA溶于双蒸水或溶于双蒸水或TETE溶液中，溶液中，即即DNADNA溶液。溶液。提取缓冲液：提取缓冲液：200 mmol/L TrisCl (pH8.0), 25mmol/L EDTA, 500 mmol/L

8、NaCl, 0.5% SDS24：1的氯仿：异戊醇的氯仿：异戊醇预冷无水乙醇预冷无水乙醇1.肝脏肝脏1g左右左右, (剪碎剪碎) 置研钵中，加入置研钵中，加入2-3mL提取提取缓冲液，缓冲液， 研磨成浆；吸入研磨成浆；吸入10mL EP管中，摇动混管中，摇动混匀；匀；2.60水浴保温水浴保温20min，不时不时颠倒混匀；颠倒混匀； 3.室温下室温下3000rpm离心离心10min；4.小心吸上清于小心吸上清于另一只另一只离心管中，加入等体积离心管中，加入等体积的的24:1的的氯仿氯仿：异戊醇：异戊醇，上下颠倒混匀上下颠倒混匀；5.室温下室温下3000rpm离心离心10min； 6.小心小心将上

9、层水相将上层水相吸入吸入另一只另一只离心管中；离心管中；7.重复重复4-5步步2-3次次; (此步不做）此步不做）8.加入加入等等体积体积预冷无水乙醇预冷无水乙醇，室温下放置片刻即出现，室温下放置片刻即出现絮状絮状DNA沉淀。沉淀。 复复温温 PCR的的三个热反应过程三个热反应过程 PCR的产量的产量u 每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。u DNA产量以指数上升，产量以指数上升，n个循环后，达到个循环后，达到2n拷贝。拷贝。4. PCR的反应体系中各组分作用的反应体系中各组分作用DNA 模板模板 (template)引物引物 (primer)4种脱氧核

10、苷酸种脱氧核苷酸 （dNTP）DNA聚合酶聚合酶 （Taq）反应缓冲液反应缓冲液Mg2+及某些使酶稳定的辅剂及某些使酶稳定的辅剂质量：要求有较高纯度的质量：要求有较高纯度的DNA样品样品避免反复冻融，防止降解避免反复冻融，防止降解数量数量: 25-100ng/20l 1）DNA 模板模板2）引物）引物 与模板与模板DNA的某个局域具有互补碱基特异性的某个局域具有互补碱基特异性的短的单链的短的单链DNA片段。片段。3）dNTP 4种种 dNTP 用量应均衡，否则会减少用量应均衡，否则会减少 Taq 酶合酶合成的忠实性，增加错配率。成的忠实性，增加错配率。l最初的聚合酶最初的聚合酶 大肠杆菌大肠杆

11、菌DNA 聚合酶聚合酶 klenow 片段片段, 不耐热，每次加热变性后需重新补加。不耐热，每次加热变性后需重新补加。 聚合温度偏低（聚合温度偏低（37 ），产生非特异性扩增），产生非特异性扩增lTaq DNA 聚合酶聚合酶 从水生栖热菌中分离，可在从水生栖热菌中分离，可在70-75生长。生长。 Taq 酶扩增效率酶扩增效率: 600bp/min 错配率错配率: 1bp/4000bp (无无3-5外切酶活性外切酶活性) 4）DNA聚合酶聚合酶作用作用: 增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。 增加增加 dsDNA 的的 Tm 值，提高融合温度。值，提高融合温度。 与游

12、离与游离 dNTP 形成可溶性复合物，有利形成可溶性复合物，有利 dNTP 渗入。渗入。浓度浓度: 1.5-2.0 mmol/l5）缓冲液中的）缓冲液中的Mg2+6）循环次数循环次数 循环次数是循环次数是2535次。次。 循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增加。加。 质粒是存在于细菌染色体外的能够自主复制的环状质粒是存在于细菌染色体外的能够自主复制的环状DNA分子。大小在分子。大小在1200kb之间，质粒之间，质粒DNA通常通常以游离状态持续稳定地处于染色体外（在一定的条以游离状态持续稳定地处于染色体外（在一定的条件下又会可逆地整合到寄主

13、染色体上），随着染色件下又会可逆地整合到寄主染色体上），随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。由体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。由于质粒于质粒DNA自身具有复制原点、可携带外源基因、自身具有复制原点、可携带外源基因、转移性强、拷贝数高、带有选择性标记等特点，使转移性强、拷贝数高、带有选择性标记等特点，使得质粒成为基因工程中最常用的得质粒成为基因工程中最常用的DNA载体。载体。l质粒质粒DNA分子具有分子具有3种不同的构型：种不同的构型：SC构型构型：共价闭合环形：共价闭合环形DNA（cccDNA），质粒的），质粒的两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构；两条多核苷酸链均保持

14、着完整的环形结构；OC构型构型：开环：开环DNA（ocDNA），质粒的两条多核苷），质粒的两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链存在一酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链存在一处至多处断裂；处至多处断裂；L构型构型：线性：线性DNA（linear DNA），质粒），质粒DNA发生双发生双链断裂而形成线性分子。链断裂而形成线性分子。l同一质粒同一质粒DNA的不同构型尽管相对分子质量相同，的不同构型尽管相对分子质量相同，但在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率却是不同的。一但在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率却是不同的。一般情况下，泳动速率由快至慢依次为：超螺旋质粒般情况下，泳动速率由快至慢依

15、次为：超螺旋质粒（SC）、线性质粒（）、线性质粒（L）、开环质粒（）、开环质粒（OC）。）。l质粒质粒DNA的提取方法较多，要根据宿主菌和质粒的的提取方法较多，要根据宿主菌和质粒的特性选择适合的提取方法。目前常用的质粒提取方法特性选择适合的提取方法。目前常用的质粒提取方法有：有：碱裂解法碱裂解法、煮沸法煮沸法。l几种方法的提取流程是一样的：培养细菌扩增质粒几种方法的提取流程是一样的：培养细菌扩增质粒收集菌体裂解细胞收集菌体裂解细胞分离和纯化质粒分离和纯化质粒DNA。 利用共价闭合环状质粒利用共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体与线状的染色体DNA片段在拓扑学上片段在拓扑学上的差异进行分离。的差

16、异进行分离。SDS使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形成蛋白质成蛋白质-SDS复合物。同时，在复合物。同时，在pH12.012.5的碱性条件下，线的碱性条件下，线状的染色体状的染色体DNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNA虽然氢键断裂，但两虽然氢键断裂，但两条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入pH4.8的醋酸钾高的醋酸钾高盐缓冲液使盐缓冲液使pH降低后，质粒降低后，质粒DNA的两条互补链由于彼此靠近而迅的两条互补链由于彼此靠近而迅速准确地复性，而线状的染色体速准确地复性，而线状的染色体DNA由于核苷

17、酸链较长且两条互由于核苷酸链较长且两条互补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网状结补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网状结构，并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染构，并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染色体色体DNA网状聚合物便与蛋白质网状聚合物便与蛋白质-SDS复合物及不稳定的大分子一复合物及不稳定的大分子一起沉淀下来，而留在上清液中的质粒起沉淀下来，而留在上清液中的质粒DNA可用苯酚、氯仿进一步可用苯酚、氯仿进一步抽提纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒抽提纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒DNA。 电泳：带电荷的物质在电场中向与自身

18、电荷相反电泳：带电荷的物质在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象称为电泳。的电极移动的现象称为电泳。在在pH8.0的电泳缓冲液体系中，的电泳缓冲液体系中，DNA分子带负电分子带负电荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反比（仅适于线性分子）。比（仅适于线性分子）。通过与已知浓度和相对分子质量大小的标准通过与已知浓度和相对分子质量大小的标准DNA片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量

19、。可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量。 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测1. 菌体的培养与收集菌体的培养与收集（1 1）从）从LBLB平板上挑细菌单菌落，接种于平板上挑细菌单菌落，接种于5ml5ml附加相应抗生附加相应抗生素的素的LBLB液体培养基中，液体培养基中，37250r/min37250r/min，过夜培养，过夜培养（用对（用对数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的ODOD620620=0.2=0.20.60.6时为对数期的菌液。也可取时为对数期的菌液。也可取1/1001/100的过夜的过夜菌液，继续摇瓶培养菌液，继续摇瓶培养2.5h

20、2.5h，此时菌液达对数期）。，此时菌液达对数期）。（2 2）取）取1.2ml1.2ml菌液放在菌液放在1.5ml1.5ml的离心管中，的离心管中，5000r/min 45000r/min 4离心离心10min10min，弃上清，弃上清（上清液中含有细菌生长过程中的代（上清液中含有细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除干净，最好用干净，最好用STESTE或生理盐水再悬浮漂洗菌体或生理盐水再悬浮漂洗菌体）。收集菌）。收集菌体后

21、选择以下方法提取质粒。体后选择以下方法提取质粒。2.质粒质粒DNA的提取（碱裂解法）的提取（碱裂解法）将收集的细菌沉淀悬浮于将收集的细菌沉淀悬浮于100l100l冰预冷的冰预冷的溶液溶液中，强中，强烈振荡混匀；烈振荡混匀；加入加入200ul200ul新配的新配的溶液溶液于细菌悬液中，迅速颠倒离心管于细菌悬液中，迅速颠倒离心管5 5次（不应振荡），以混合内容物，室温放置次（不应振荡），以混合内容物，室温放置5min5min或冰上或冰上放置放置3min.3min.加入加入150l150l预冷的预冷的溶液溶液，盖紧管口，颠倒离心管，盖紧管口，颠倒离心管5 51010次，使溶液次，使溶液在黏稠的细菌裂

22、解物中分散均匀，随后将在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将管置于冰上管置于冰上5 510min10min。 12 000 rpm 12 000 rpm离心离心10 min10 min，将上清液转移至另一新离心管，将上清液转移至另一新离心管中。中。 加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min10 min。 12 000 rpm 12 000 rpm离心离心10 min10 min，弃上清。，弃上清。 加入加入500 l500 l 70 70乙醇，盖紧管盖，颠倒并旋转离心管乙醇，盖紧管盖，颠倒并旋转离心管以洗涤沉淀。以洗涤沉淀。 12 000 rpm

23、12 000 rpm离心离心2 min2 min，用移液器吸走上清，打开管盖，用移液器吸走上清，打开管盖于室温下放置于室温下放置10-15 min10-15 min，使酒精挥发干净。，使酒精挥发干净。 待沉淀干燥后，加入待沉淀干燥后，加入50 l50 l TE TE缓冲液溶解质粒缓冲液溶解质粒DNADNA。3.琼脂糖凝胶电泳检测（琼脂糖凝胶电泳检测（合并下次一起电泳合并下次一起电泳） （1）凝胶制备凝胶制备 取琼脂糖取琼脂糖0.8g0.8g，加入，加入100ml100ml的的1 1TAETAE电泳缓冲液，配成浓电泳缓冲液，配成浓度为度为0.8%0.8%的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。微波炉加热煮沸

24、，使琼脂糖完全溶微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶解（注意不要溅出）。解（注意不要溅出）。待凝胶溶液冷却至待凝胶溶液冷却至 6060左右时，加左右时，加入溴化乙锭至终浓度为入溴化乙锭至终浓度为0.5g0.5gmlml，倒进制胶模具中。，倒进制胶模具中。 室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶的模具的模具放置于电泳槽中。放置于电泳槽中。实验步骤实验步骤称琼脂糖称琼脂糖加加TAE加热溶解加热溶解加加EB灌胶灌胶凝固凝固放入电泳槽放入电泳槽加溴酚蓝加溴酚蓝点样点样电泳电泳观察拍照观察拍照质粒质粒DNA实验六实验六大肠杆菌感受态细胞的制备、大肠

25、杆菌感受态细胞的制备、重组重组DNA的转化、克隆筛选的转化、克隆筛选1. 实验目的和要求实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。生物学研究中的意义。2. 相关知识及原理相关知识及原理感受态细胞感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法（如：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的等化

26、学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源通透性发生变化，成为能容许多有外源D N A 的 载 体 分 子 通 过 的 感 受 态 细 胞的 载 体 分 子 通 过 的 感 受 态 细 胞(competent cell) 。 转化（转化（transformation）：是将异源是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受

27、体细胞出现新的遗传性遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。甲基化酶的突变株。转化的方法：转化的方法：1. 化学的方法化学的方法(热击法热击法)；使用化学试剂（如；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体理将载体DNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体感受态

28、细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。克隆的筛选：克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，基

29、平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。克隆含有插入片段。重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有 -互补、小规模制备质粒互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、进行酶切分析、插入失活、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最以及杂交筛选

30、的方法。最常用的方法是小规模制备质粒常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶进行酶切分析，对于带有切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以基因的载体还可以结合结合 -互补现象来筛选。互补现象来筛选。 -互补现象：互补现象：因为许多载体都带有一个因为许多载体都带有一个LacLacZ Z基因的调控序基因的调控序列和头列和头146146个氨基酸的编码信息，编码个氨基酸的编码信息，编码 - -互补互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 - -半乳糖半乳糖苷酶实现基因内互补（苷酶实现基因内互补（ -互补互补）。）。当这种载当这种载体转入可编码体转入可编码 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C

31、C端部分序列的端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基宿主细胞中时，在异丙基- - -D-D硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）的诱导下，）的诱导下，宿主可同时合成这两种宿主可同时合成这两种肽段，肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为以称这种现象为 - -互补现象。互补现象。由互补产生的由互补产生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶( (LacLacZ Z) )能够作能够作用于生色底物用于生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚 D D半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)(X-gal)而

32、产生蓝色的菌落，所而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源外源DNADNA片段时，会造成片段时，会造成LacLacZ Z( ( ) )基因的失活，基因的失活，破坏破坏 -互补作用，互补作用，就不能产生具有活性的酶。就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。组质粒的菌落为蓝色。重组重组DNADNA转化细菌过转化细菌过程示意图程示意图3仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂无菌超净台，电热恒温

33、水浴，分光光度计，离心无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等；机，移液器，微型离心管等；菌株：菌株：E.coliE.coli DH5 DH5质粒：质粒：pBluscript KS+DNA 片段的质粒以及片段的质粒以及 pBluscript KS 空质粒；空质粒；LBLB培养基；含抗菌素的培养基；含抗菌素的LBLB平板培养基（氨苄青霉平板培养基（氨苄青霉素，浓度素，浓度50-10050-100g gmLmL，X-gal 20-48X-gal 20-48g/ml, g/ml, IPTG 100 IPTG 100 g/mlg/ml。一般将抗生素、。一般将抗生素、X-gal

34、X-gal和和IPTGIPTG配制成配制成10001000 储备液，用时按培养基的量再加储备液，用时按培养基的量再加入入）；）；预冷预冷CaClCaCl2 2溶液（溶液（0.1mol0.1molL L） 4操作步骤操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法法) （1）从新活化的）从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取菌平板上挑取一单菌落，接种于一单菌落，接种于35ml LB液体培养中，液体培养中，37振荡培养振荡培养12h左右，直至对数生长期。左右，直至对数生长期。将该菌悬液以将该菌悬液以1:1001:50转接于转接于100ml LB液液体培养基中，体培

35、养基中，37振荡扩大培养，当培养液振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔开始出现混浊后，每隔2030min测一次测一次OD600nm，至，至OD600nm0.5时停止培养；时停止培养；（2）每组取培养液）每组取培养液3个个2ml转入转入2ml离心管离心管中，在冰上冷却中，在冰上冷却20-30min，于，于4，4000rmin离心离心10min（从这一步开始，所有（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；（3）倒净上清培养液，用）倒净上清培养液，用1ml冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰溶液轻轻悬浮细胞，冰浴浴；（4）

36、04，4000rmin离心离心10min；（5）弃去上清液，加入）弃去上清液，加入500l冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。溶液，小心悬浮细胞。04，4000rmin离心离心10min；（6）弃去上清液，加入）弃去上清液，加入100l冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置离心管中，置于于-70条件下，可保存半年至一年。条件下，可保存半年至一年。2）细胞）细胞转化转化 (1) 分别取分别取3个个100l感受态细胞悬液感受态细胞悬液(如是如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作操作)，第一组，加入，第一组，加入10 l重组质粒重组质粒DNA(体积不超过体积不超过10l)+ 100l感受态细胞，感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入此管为转化实验组。第二组，插入DNA片片段对照组，即酶切后段对照组，即酶切后DNA片段