哺乳动物细胞培养：基础交流PPT课件

1、Meeting date: 2009/12/18Speechmaker Youzhi Huang（Ph D）E-mail: serviceresearch- :上海锐赛生物技术有限公司上海锐赛生物技术有限公司 Shanghai R&S Biotechnology Co., Ltd.High technology and service Eyeing for Integrated Solution R&S, your reliable cooperator!High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R

2、&S, your reliable cooperator! 细胞培养定义细胞培养定义 细胞培养细胞培养简史简史 生长类型生长类型 细胞形态细胞形态 传代次数传代次数High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞培养定义细胞培养定义u定义：定义： 模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。u优点：优点：1活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2可控制： 各

3、种物理、化学、生物等因素可调控；3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；u缺点：缺点： 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞培养简史细胞培养简史High technology and servic

4、e, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞类型细胞类型按生长方式: 贴壁型细胞（Monolayer cells） 悬浮型细胞（Suspension cells）l 绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。按细胞形态(贴壁细胞）： 成纤维型细胞（Fibroblast-liked cells） 上皮型细胞（Epithelium-liked cells） 其它，不定型High technology and service, Eyeing for In

5、tegrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 成纤维型细胞梭形或不规则三角形中央有卵圆形核胞质向外伸出长短不同的突起中胚层间质起源 上皮型细胞扁平不规则多角形细胞中央有圆形核紧密相连单层膜样生长内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞散在生长，一般不连成片细胞质经常伸出伪足或突起活跃的游走或变形运动羊水细胞培养的早期多形细胞型 难以确定规律和稳定的形态 如神经组织的细胞等 细胞形态细胞形态High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&a

6、mp;S, your reliable cooperator! 接触抑制接触抑制（Contact inhibition） 细胞相互接触时，将停止增长； 细胞停留在细胞周期的G0期； 转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 传代次数

7、与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。 细胞传代次数细胞传代次数（Passage Number）High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 原代培养 （primary culture）从动物机

8、体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 细胞系（cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 细胞株（cell strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。 原代培养与细胞系原代培养与细胞系 The American Type Culture Collection (ATCC) The European C

9、ollection of Animal Cell Culture (ECACC) National Institute of Health (NIH), USA National Cancer Institute (NCI), USA细胞系资源细胞系资源High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 二、细胞培养基本要求二、细胞培养基本要求 常用仪器设备常用仪器设备 培养器皿培养器皿 培养基培养基 血清血清 其他细胞培养试剂其他细胞培养试剂High t

10、echnology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 常用仪器设备 超净台或生物安全柜：超净台或生物安全柜：细胞操作 CO2 培养箱：培养箱：细胞培养 液氮罐：液氮罐：细胞长期冻存 37 水浴：水浴：培养溶液预热，细胞复苏 倒置显微镜：倒置显微镜：观察细胞 离心机：离心机：收集细胞，细胞常用300g转速5min 冰箱：冰箱：细胞培养溶液分装储存 负压吸引器：负压吸引器：细胞培养废液吸取High technology and service, Eyeing for Int

11、egrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 超净台或生物安全柜超净台或生物安全柜垂直风超净台垂直风超净台水平风超净台水平风超净台生物安全柜生物安全柜High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 培养器皿High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator!

12、 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 培养基的选择培养基的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考： 1.建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 2.其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 3.用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 High technology

13、 and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 血清使用注意事项血清使用注意事项1.血清必须贮存于20 -70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2.血清解冻步骤(逐步解冻法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由

14、20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。3.热灭活（heat-inactivation）是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。4.勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable co

15、operator! 凝絮物：凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物

16、，因为会阻塞过滤膜。塞过滤膜。 显微镜下观察之显微镜下观察之“小黑点小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点小黑点”，常，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此中欲培养此“微生物微生物“，但在但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会

17、影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。另一批号的血清。 血清沉淀物血清沉淀物 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，44下放置下放置7 7天天即可分

18、解约即可分解约50%50%，所以都是在使用前添加，所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在配制好的培养液（含谷氨酰胺）在44放置放置2 2周以上时，要重新周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内入培养液内使用终浓度为使用终浓度为1-4mM1-4mM一般配制为一般配制为100100倍浓缩液，即浓度为倍浓缩液，即浓度为200mM200mM（29.22g/L29.22g/L）配制方法为配制方法为 ：谷氨酰胺谷氨酰胺2.922g2.922g溶于三蒸水加至溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成

19、200mM200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温的溶液，充分搅拌溶解后（应加温3030），过滤除菌，分），过滤除菌，分装小瓶，装小瓶，-20-20保存，使用时可向保存，使用时可向100ml100ml培养液中加入培养液中加入0.5-2ml0.5-2ml谷谷氨酰胺浓缩液，终浓度为氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM 1-4mM High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! High technology and service, Eyeing for In

20、tegrated Solution, R&S, your reliable cooperator! High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 三、细胞培养基本技术三、细胞培养基本技术 细胞原代培养细胞原代培养 细胞换液与传代细胞换液与传代 细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏 细胞计数与活力细胞计数与活力 细胞污染与控制细胞污染与控制High technology and service, Eyeing for Integrated Soluti

21、on, R&S, your reliable cooperator! High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 换液：全量换液和半量换液换液时机的选择：培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。细胞状态细胞换液High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator

22、! High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞计数及活力细胞计

23、数及活力High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞污染细胞污染 细菌污染细菌污染 真菌污染真菌污染 细菌和真菌的清除细菌和真菌的清除 支原体污染支原体污染 支原体的清除支原体的清除High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细菌污染细菌污染 细胞培养常见的污染最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及

24、大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 真菌污染真菌污染 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S

25、, your reliable cooperator! 细菌和真菌的清除细菌和真菌的清除 使用抗生素 抗生素对杀灭细菌较有效。 联合用药比单独用药效果好。 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 污染后清除用药需采用大于常用量510倍药物冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 9595以上是以下四种支原体：以上是以下四种支原体：口腔支原体（口腔支原体（M.oraleM

26、.orale）精氨酸支原体（精氨酸支原体（M.argininiM.arginini）猪鼻支原体（猪鼻支原体（M.hyorhinisM.hyorhinis）牛莱氏无胆甾原体（牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawiiA.laidlawii）危害：危害：世界性问题，平均发生率达到世界性问题，平均发生率达到11%11%能改变细胞的能改变细胞的DNA,RNADNA,RNA及蛋白表达及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染来源：来源：操作环境不良操作环境不良操作人员的疏失操作人员的疏失实验器具不洁等实验器

27、具不洁等已受污染的细胞已受污染的细胞已受污染的培养基、血清已受污染的培养基、血清支原体污染支原体污染High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 荧光染色法荧光染色法电镜检查电镜检查：扫描电镜扫描电镜、透射电镜透射电镜支原体培养支原体培养聚合酶链反聚合酶链反应应(PCR)法法支原体污染检测支原体污染检测High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your

28、reliable cooperator! 细胞营养液常常细胞营养液常常仍清亮但仍清亮但变黄变黄,细胞生长变缓细胞生长变缓，部分细胞发部分细胞发生脱落等等生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点，细胞间隙可见铺满细沙样小点。支原体污染表现支原体污染表现High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 支原体的清除支原体的清除 支原体清除剂支原体清除剂MRA （Mycoplasma Removal Agent）处理法）处理法每每4天换一次液，连续处理天换一次液

29、，连续处理15天天 清洗纯化法清洗纯化法细胞营养驯化细胞营养驯化优质细胞群的筛选优质细胞群的筛选细胞清洗细胞清洗反复离心洗涤反复离心洗涤 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 药物辅助高温处理法药物辅助高温处理法先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41培养

30、培养18小时，可杀小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。死支原体，但对细胞有不良影响。 支原体特异性血清法支原体特异性血清法 用用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。个月后仍为阴性。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 四、锐赛细胞相关技术服务四、锐赛细胞

31、相关技术服务上海锐赛生物公司简介上海锐赛生物公司简介锐赛细胞相关技术服务锐赛细胞相关技术服务High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 上海锐赛生物简介上海锐赛生物简介上海锐赛专注于向国内生命科学研究、医学临床科研应用上海锐赛专注于向国内生命科学研究、医学临床科研应用及生物医学产业研发提供最新技术咨询、全方位现代实验及生物医学产业研发提供最新技术咨询、全方位现代实验技术服务。技术服务。锐赛公司前身是一个生命科学研究交流团队，团队组建于锐赛公司前身是

32、一个生命科学研究交流团队，团队组建于20032003年，是非盈利的学术交流平台，技术团队建有基因操年，是非盈利的学术交流平台，技术团队建有基因操作、基因组分析、细胞、病毒包装、作、基因组分析、细胞、病毒包装、RNAiRNAi等多个成熟的实等多个成熟的实验平台，团队人员操作经验丰富，硕士学历以上占验平台，团队人员操作经验丰富，硕士学历以上占85%85%。公司愿景：立足于深厚的分子、细胞生物学背景和扎实的公司愿景：立足于深厚的分子、细胞生物学背景和扎实的科研实验技术服务基础，立命于终身为祖国的科研工作者科研实验技术服务基础，立命于终身为祖国的科研工作者提供一流的研究产品和全方位实验技术服务，并孜孜

33、不倦提供一流的研究产品和全方位实验技术服务，并孜孜不倦地打造出我们自己研发生产的、比国际一流品牌产品还过地打造出我们自己研发生产的、比国际一流品牌产品还过硬的科研产品民族品牌！硬的科研产品民族品牌！ High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 锐赛细胞相关技术服务锐赛细胞相关技术服务细胞转染细胞转染瞬时转染稳定转染细胞株的构建流式细胞检测流式细胞检测细胞周期细胞凋亡细胞表面抗原（CD系列）肿瘤细胞生物学检测肿瘤细胞生物学检测细胞活力测定肿瘤细胞基质

34、黏附实验肿瘤细胞侵袭实验病毒包装病毒包装腺病毒包装慢病毒包装逆转录病毒包装RNA干扰干扰siRNA干扰评价慢病毒RNAi干扰腺病毒RNAi干扰High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞转染细胞转染瞬时转染瞬时转染特点：特点：技术平台：阳离子脂质体、阳离子聚合物（FuGene）、电穿孔仪等根据客户的靶细胞系选择最高效的转染方法并进行转染条件的优化应用：应用：观察目的基因表达蛋白在细胞中的功能（短期效应）稳定转染细胞株构建稳定转染细胞株构建特点特

35、点：技术平台：阳离子脂质体、阳离子聚合物（ FuGene）、电穿孔仪、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等根据客户选择的靶细胞系选择最高效的转染方法并进行转染条件的优化可选用高效的病毒转导方法建立稳定表达的细胞株应用抗生素筛选出稳定表达细胞株应用：应用：观察目的基因表达蛋白在某种细胞中的功能（稳定，可长期研究）High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 流式细胞检测流式细胞检测特点：特点：技术平台：FACSCalibur7500 单细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析特定细胞群体的分选精度和灵敏度高，重复性好应用：应用：细胞周期细胞凋亡细胞表面抗原：CD 系列High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 肿瘤细胞