成骨成脂诱导

1、间充质干细胞成骨及成脂诱导培养基标准制作方法浏览：185I更新：2013-07-01 11:12间充质干细胞培养细胞诱导分化时必然用到的就是培养液，配置出合适的培养液能够促进 细胞的分化，因此这一步操作时相当的关键。如何才能配置适合的诱导培养液呢？济南中 赛生物来介绍成骨与成脂诱导培养液的配备方法。成骨诱导培养液配备与诱导操作：1. 准备含10%FBS勺a -MEM培养液；2. 在备好的a -MEM培养液中添加50卩M抗坏血酸，10mm B -磷酸甘油和100nm地塞米松；3. 准备6孔培养板，将P4细胞按照5X 103个/平方厘米的规格接种于原始a -MEM培养液 中；4. 待细胞长至基本融

2、合后，更换上述制备完成的成骨诱导培养液；5. 每三天换液一次，细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色；6. 二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色。茜素红染色方法介绍：1. 去除细胞当前使用培养液，使用 PBS青洗两次；2. 使用10%?醛室温固定15分钟，完成后使用重蒸馏水冲洗两次；3. 按照1ml/孔加入40mM勺茜素红染色液，室温孵育20min并轻微振荡；4. 清除掉没有完全结合的染料，用重蒸馏水漂洗并振荡5min重复4次;5. 倾斜放置2min,吸取多余的重蒸馏水；倒置显微镜观察拍照记录。成脂诱导培养液配备与诱导操作：1. 配置FBS10含量的HG-DME培养液；2. 在配制完成的HG-DME

3、培养液中加入1卩M地塞米松,10卩g/ml胰岛素，200卩M吲哚美辛 和 0.5mM IBMX3. 准备6孔培养板，将P4细胞按照2X 104个/平方厘米的规格接种于原始 HG-DME培养液 中4. 待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养 2天，在用只含有10 卩g/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用红油O染色。红油O染色方法介绍：1. 去除细胞使用的当前培养液，使用 PBS青洗两次；2.27.5%甲醛室温固定20分钟；3. 重蒸馏水清洗3此，空气中干燥；4. 加入0.5%的红油室温孵育一小时；5. 配制70%L醇溶液清洗3次；6. 倒置显微

4、镜观察拍照记录。丁香园二、诱导成骨体系试剂？?溶剂？?终浓度？?储存浓度?1ml体系加量Dex?去离子水？0.1 卩 M?1mM?0.1 LVc?PBS?50 M?50mM?1LB -磷酸甘油?PBS?10mM?1M?102. DMEMHG 和 10%FBS3. 3代以上细胞，24孔板每孔105个细胞，六孔板每孔6000个细胞，每三天半量换液, 共诱导2周。成骨诱导剂：地塞米松(1 x 10-8mol/L )， B -甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C 50ng/ml，高糖DMEM青链霉素各100u/ml，体积分数10%勺胎牛血清。兔骨髓间质干细胞成骨诱导分化基础培养基175 mL兔骨髓间质

5、干细胞培养专用胎牛血清20 mL谷氨酰胺2 mL双抗2 mL抗坏血酸400 卩 LB-甘油磷酸钠2 mL地塞米松20卩L成骨诱导培养基成分:成脂诱导培养基成分:兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基 A液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基 A175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL谷氨酰胺2 mL双抗2 mL胰岛素400 卩 LIBMX（IBMX, 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）200 卩 L罗格列酮（吲哚美辛）200 卩 L地塞米松200 卩 L兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基 B175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL双

6、抗2 mL谷氨酰胺2 mL胰岛素400 卩 L10%&度）。！须用无水乙醇溶解对成脂肪诱导要特别提醒你，用国产血清比进口的效果更好（仍为我用的是SIGMA的地塞米松（D175®, 25mg包装的，248元贵的惊人!我也用过病房常用的5mg的地塞米松磷酸钠，效果也挺好的。至少可以配成 1:1000首选的是 dexamethasone-water soluble, cell culture tested的母液，使用起来很方便。使用医用制剂尤其要小心溶剂的问题，好些制剂不是融解在水里的，如果你没有设置合适 的阴性对照，会给你的实验带来 Bug。脂肪诱导培养液：DMEM,1FCS 1

7、0-6M地塞米松，100微克/ ml 1一甲基一 3 一异丁基一黄嘌呤，50微克/ ml抗坏血酸。很难找到一套抗兔的抗体。油红染色的方法如下：脂肪油红染色（原位）：1. 称取0.5g油红干粉，溶于100mL异丙醇中，配成0.5 %油红储存液，棕色瓶保存。2. 除去培养基用PBS洗涤1遍3. 加10%中性甲醛固定5min4. 稀释油红储存液，油红；去离子水=3:2，滤纸过滤，室温放置 10min （除去一些杂质， 染色结果更清晰）5. 染色30min，如果是培养皿或培养板，加的体积覆盖住板底即可。如6孔加1.5ml，24孔加 0.5-1ml 。6. 显微镜观察，及时照相，时间过长，脂肪滴会自发破裂，到时就前功尽弃了，几个星期 的努力欧！这位大虾的油红染色方法基本正确，但有几个地方修改一下后效果会更好！第一，染色的