肿瘤免疫治疗新方法

1、 自体细胞免疫疗法 CIK cytokine-induced killer ，中文名：自体细胞免疫疗法多 种细胞因子诱导的杀伤细胞 是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子如抗 CD卅克隆抗体、IL-2和 IFN- 丫等共同培养一段时间后获得 的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达 CD3菲口 CD56-W种膜蛋 白分子,故又被称为 NK细胞样 T淋巴细胞,兼具有 T淋巴细胞强 大的抗瘤活性和 NK细胞的非 MHC艮制性杀瘤优点。因此，应用 CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。 CIK细胞中的效应细胞 CD3却 CD56老田胞在正常人外周血中极其 罕见，仅 1吩 5% 1

2、 CIK特点 CIK 细胞中的效应细胞 CD3+CD56+胞在正常人外周血中极 其罕见，仅 1吩 5% 在体外经多因子培养 28 30天，CD3+CD56+ 细胞迅速增多，较培养前升幅可达 1000倍以上。实验证明，扩 增出的 CD3+CD56+胞来源于 CD3+CD56-T胞，而非 CD3-CD56+N酬胞。同时发现在 CD3+CD56的 T细胞中，除 CD4-CD8-T细胞外，其余三种 T细胞亚群CD4-CD8+ CD4-CD8- CD4+CD8+均可通过体外多因子培养而获得 CD56分子的表达， 而由于 CD4+CD8+胞和 CD4-CD8细胞在正常人外周血中含量极 低而间接提示此 CD

3、3+CD56+胞绝大多数来源于外周血中 CD4-CD8+1H胞。而由于CD4-CD8-T细胞在培养1个月后有近56% 的T细胞同时表达 CD56和 CD3说明其也是 CIK细胞的重要来 源。比拟 CD3+CD56+CIK田胞中表达 CD8苗口 CD8-,的两群细胞其 杀瘤活性没有显著性差异，提示 CIK细胞的细胞毒性与 CD3CD56 表达成相关趋势，而与 CD8的表达未表现出相关性。 杀伤原理 CIK细胞能够通过三种途径杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞： CIK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的直接杀伤： CIK细胞 可以通过不同的机制识另 U 肿瘤细胞，释放颗粒酶 /穿孔素等毒性 颗粒，导致肿瘤细胞

4、裂解。 CIK细胞释放的大量炎性细胞因子具有抑瘤杀瘤活性： 体外 培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如 IFN- 丫、TNF-a、 IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体 免疫系统反响性间接杀伤肿瘤细胞。 CIK细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡： CIK细胞在培养过程中 表达FasL 口型跨膜糖蛋白 通过与肿瘤细胞膜表达的 Fas I 型跨膜糖蛋白结合，诱导肿瘤细胞凋亡。 CIK细胞发挥作用的三种途径 杀瘤特点 应用 LAK细胞是目前较为普及的肿瘤过继免疫治疗方案， 广 泛使用于黑色素瘤、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和结肠癌。 因LAK 细胞扩增数量有限，杀瘤活性也较 TI

5、L 等 T 淋巴细胞为 低，故虽然杀瘤谱广，但效果局限。相比拟而言， TIL细胞本身 较 LAK 细胞具有更强大的抗瘤效力，但由于杀瘤谱窄，制备困难， 及在收集过程中可能导致的功能改变而限制了其临床应用价值。 与上述两种效应细胞过继免疫治疗相比， CIK细胞具有独特的优 势，列举如下。 1. 增殖速度快 CIK细胞在培养过程中参加 IFN- 丫、IL-1、抗 CD3 McAb IL-2 等多因子后，细胞增殖速度迅速加快，远超过 LAK细胞。 在培养第 22天增殖曲线达顶峰，约增加 100倍，其中 CD3+CD56+ 细胞不仅绝对数量增加 1000倍以上，且所占百分比也大幅上升， 培养至28 3

6、0天时达平台期，细胞毒活性亦达峰值，而 LAK细 胞培养前后数量没有明显增加。 2. 杀瘤活性高 CIK细胞是以CD3+CD56+TB胞为主的异质细胞群，大量体内 外实验证实CIK细胞较以NK胞为主的LAK细胞具备 更强大的杀瘤活性，而且其体内杀瘤细胞毒性的维持不必依赖大 剂量外源性 IL-2 的持续给予。体外实验中，任欢和 Lu等均发现 在体外等数量的 CIK细胞比 LAK细胞对肿瘤细胞系的杀伤能力稍 高或相近，但因 CIK细胞在培养过程中 CD3+CD5微应细胞增长 迅速，故CIK细胞的总杀伤单位TLU为 LAK细胞的 73倍甚 至更高，其杀伤效率显著高于 LAK细胞。肿瘤克隆抑制实验显示

7、， CIK细胞的瘤细胞抑制 Log指数为 2.5 3.5 ,较 LAK细胞的瘤细 胞抑制指数高 2个 Log。体内实验发现，对于在严重联合免疫缺 陷小鼠身上构建的人类 B细胞淋巴瘤 SU-DHL4 模型，CIK细胞在 去除荷瘤鼠体内肿瘤病灶， 抑制转移，延长生存期等方面的作用 均明显优于 LAK细胞。 3. 杀瘤谱广 CIK 细胞虽然以 CD3+CD56+T 细胞为主要效应细胞，但却没有 T 淋巴细胞杀伤时的 MHC限制性，故对于多种肿瘤细胞系包 括 NK敏感的 K562 和 NK 不敏感的 Hela、HL6Q 人 T 细胞急淋白 血病细胞系 OCRF-CEM 人淋巴瘤细胞系 OCI-LY8、

8、LAM53 人结 肠癌细胞系HT-29、CR7Q人肾癌细胞系 A704和新鲜肿瘤组织 均表现出强大的杀伤活性。 4. 对多重耐药肿瘤细胞同样敏感 Wolf用阿霉素和长春新碱诱导出多重耐药细胞系 K562/DOXffi CCRF-CEM-VB匿现 CIK细胞对化疗药物敏感的亲本细胞和不敏 感的转化细胞均具有强大的杀伤活性，两者比拟无差异。 5. 杀瘤活性不受 CsA FK506等免疫抑制剂的影响 Mehta观察到免疫抑制剂 CsA和 FK506虽然可以抑制抗 CD3H 抗介导的 CIK 细胞脱颗粒过程，却不影响靶细胞诱导的 CIK 细胞 脱颗粒，并且 CIK细胞对靶细胞的杀伤活性不会因此降低。

9、6. 对正常骨髓造血前体细胞毒性很小 Seheffold通过 CFU-G噬成实验检测 CIK细胞对骨髓造血前 体细胞的影响，发现 CIK细胞对 K562细胞的杀伤强度高达 3级， 但对GM-CF成有缺乏 1级的抑制。 Holye 也证实 CIK 细胞对正常髓系克隆生成几乎没有影响， 只 是对红系的生成显示出轻度抑制， 这可能与 CIK细胞自身分泌较 高水平的IFN- T有关。 7. 能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞 Fas-FasL凋亡 已证明过继免疫治疗失败的一个重要原因是过继效应细胞被 肿瘤细胞外表表达的某些蛋白主要是 FasL诱导凋亡，而 CIK 细胞虽然在 Fas被占据后会引起少量细胞凋亡

10、， 但对其杀瘤细胞 毒性没有明显影响。Verneris的实验提示 CIK细胞内有抗凋亡 基因表达，并检出多种保护基因，如 cFLIP、Bcl-2、Bcl-X1、 DAD1和survivin 的转录水平上调。同时发现 CIK细胞具备合成 FasL的能力，CIK细胞培养上清中可以检测到具生物学活性的水 溶性 FasL,说明 CIK细胞可以对抗体内 FasL阳性肿瘤所引发的 效应细胞活性下降甚至消 失。 影响杀伤活性的因素 1. 外源性细胞因子的补充 CIK细胞的体外扩增需要外源性细胞因子，如 IL-2、IL-7、 IL-12等的辅助，这些因子控制着人免疫系统内各种抗原特异性 细胞的扩增及其生物学活

11、性。 外源性 IL-2、IL-7、IL-12可以显 著促进淋巴细胞的生长，尤其存在有 IL-2和 IL-7 条件下 CIK 细胞的增殖率为高，而外源性,IL-2、IL-7、IL-12对 CIK细胞 的细胞毒活性没有影响。 外源性 IL-2和 IL-7 的刺激会降低 CIK 细胞外表相应受体的表达量，而 CD28分子在 IL-7 存在条件下较 IL-2时表达更高。IL-12会降低 CIK细胞外表 ICAM-1 的表达， IL-7 那么会提高 CD56的表达。与 IL-2相比,IL-7可明显增加 CD4+ 细胞的比例。虽然外源性 IL-2、IL-7 和 IL-12培养过程中均可 出现少量凋亡细胞，

12、但有研究显示外源性 IL-12的添加会增加 CIK细胞中坏死细胞的比例。 抗 CD3McA虾仅在 CIK细胞培养过程中起着重要作用， 在提高 CIK细胞对白血病及淋巴瘤的杀伤敏感性上同样具有促进作用。 Lefterov将抗 CD3McAlfe 靶细胞预先共同孵育可增加 CIK细胞 对其的杀伤敏感性，而且这种增强作用可以被抗 FcR的抗体如 抗 CD36抗 CD32所局部阻断，间接证明抗 CD3McAlg|发的杀 伤活性增高与 FcR介导的抗体结合有关。 2. 多种细胞因子基因的转染 由于 CIK 细胞扩增对外源性细胞因子有依赖，因此通过基因转 移方法将相关基因转入 CIK 细胞，不仅可减少外源

13、性细胞因子的 使用量，还可提高 CIK细胞自身的抗瘤活性。 IL-7 : Fitke 利用改良的腺病毒转基因系统将人 IL-7 基因转 染 CIK细胞，发现转染后细胞可以生成较高浓度 IL-7 ,最多者 可达 1 100pg/106cell/24h 。合成的 IL-7 具有明显的生物学活 性，可以促进转染 CIK 细胞的增殖，显著高于未转染细胞。外源 IL-7基因的表达同时改变了 CIK 细胞对其他细胞因子的分泌， 其中尤以TNF-a 分泌显著升高，这一现象在未转染 CIK体外添 加 IL-7 时并未观测到。虽然转染后 CIK细胞外表各种与细胞杀 伤活性相关的外表抗原，如 ICAM-1等与未转

14、染 CIK细胞相比无 明显变化，但转染后 CIK细胞在对多种肿瘤细胞系如肾癌、 恶性 黑色素瘤以及结肠癌的杀伤能力较未转染 CIK细胞有明显增强。 IL-2 : Lu 等发现 CIK细胞培养过程中 CD56分子的表达是 IL-2 依赖性的，但单独 IL-2 的存在却会降低培养后 CIK细胞的表型 变化幅度。尽管有实验指出 CIK细胞的体内治疗并不需要 IL-2 体外持续供应，但 Zoll等的研究结果说明，体外培养中 IL-2 对 CIK细胞的增殖和杀伤功能有促进作用。 Schmidt-Wolf将包 含人 IL-2 基因片段的重组质粒用电穿孔法导入 CIK细胞治疗转 移性实体瘤，发现转染后细胞可

15、分泌较高水平的 IL-2 (330-1 800pg/106 cell/24h ，平均达 836pg/106 cell/24h )。虽然转 染前后 CIK细胞外表各种膜蛋白表达并无显著变化， 但体外检测 转染后 CIK细胞在增殖率和细胞杀伤活性上均高于未转染细 胞。 制备流程 CIK细胞制备流程 抽取患者的外周血，在 37C, 5%勺二氧化碳培养箱中孵育 2h,使用高速离心机别离，收集悬浮细胞，在体外(模拟人体内 环境)，参加多种细胞因子如 CD3单抗，IFN-R , IL-2 等培养， 每隔 2-3天换一次培养液，第 7、11、13、15天收集 CIK细胞， CD3苗口 CD56老田胞迅速增多

16、，较培养前升幅可达 1000倍以上。 开展历程 1985年美国外科医生首次发现大剂量的 IL-2 在体外可以将 淋巴细胞培养成具有很强肿瘤杀伤作用的细胞，称为 LAK细胞。 以后发现在培养液中参加 CD3单克隆抗体可以将这些细胞的肿 瘤杀伤活性提高十几倍，扩增的数量也大幅提高，这种细胞称为 CD3AK在这个根底上再在培养液中参加 INF-r、IL-1 等细胞因 子，得到表达 CD3CD8CD5邵日性的异质细胞群，这些细胞称为 CIK,相比 LAK细胞增殖倍数更多，杀毒活力更强。 1991年美国斯坦福大学 Schmidt Wolf等人首次报道了 CIK细 胞。 国内临床应用情况和相关政策法规 早

17、在 1996年国内已有 CIK细胞治疗技术临床应用的研究论 文发 表，目前国内已有超过百家的医疗单位开展了该项治疗技术 的相关临床应用与研究。 根据国际国内细胞治疗临床应用的进展状况， 2021年 5月 1 日卫生部颁发执行的 ?医疗技术临床管理应用方法? 将“自体免 疫细胞治疗技术列为三类医疗技术。 2 适应症 CIK 细胞治疗属于过继细胞免疫疗法，由于 CIK 细胞溶瘤作 用是非 MHC艮制性的，即不受肿瘤组织类型的限制， 因此对任何 一种肿瘤均有杀伤作用，但对高抗原表达的癌症疗效最好，如： 髓性白血病、黑色素瘤、肾细胞癌、转移性肾癌、非何杰金氏淋 巴瘤等。其它癌症如肺癌、结肠癌、乳腺癌、

18、肝癌、胃癌、大肠 癌等，CIK细胞治疗亦有较好的疗效。 CIK细胞治疗适用于任何 一期的癌症患者，但对早期肿瘤患者或经过手术及放化疗后肿瘤 负荷较小的患者效果好。它对于手术、放化疗或造血干细胞移植 后患者体内微小残留病灶的去除， 防止癌细胞扩散和复发，提高 患者自身免疫力，减少毒性反响等方面具有重要作用。 某些不适 台手术、不能耐受放化疗的中晚期肿瘤患者， CIK细胞治疗可以 提高其生活质量，延长带瘤生存时间。 特点 1. CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，且细 胞活性也大大增强。 2. CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。 3. 杀瘤谱广，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多 种肿瘤的治疗，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感。 4. 是典型