毕赤酵母实验操作手册

1、毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许 多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶 水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构 复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级 结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠， 是以包含体状态存在。 包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋 白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。与大 肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗

2、传操作简单等原 核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折 叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加 工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产 品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆 菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产 物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以 酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物

3、，不 但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统 基因表达调控和蛋白修饰功能， 避免了产物活性低， 包涵体变性、 复性等等间题 1。与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制 和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae)分子 遗传学方面的认识最早， 酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时， 培养基中维特质粒高拷

4、贝数的选择压力消失 ，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特，因此 引起产量下降。 同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养 基时，往往导致产量的下降。 为克服酿酒酵母的局限，人们发展了以 甲基营养型酵 母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统2。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表 达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该 系统除了具有一般酵母

5、所具有的特点外，还有以下几个优点1、2、3； 具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一 。 表达质粒能在 基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定 整合 。（即同源重 组） 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 毕赤酵母中存在过氧化物酶体， 表达的蛋白贮存其中， 可免受蛋白酶的降解， 而 且减少对细胞的毒害作用。Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基 因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物 有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子 AOX1 ，已高 效表达

6、了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素 C片段、基因工程抗体等多种外源基因， 证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征 的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模 4。目前美国 FDA已能评所以该系统被认为是安全的Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越 来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工 程产品2、3。近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品， 短短几年已经 有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达， 被认为是目前最有效的酵母表达系统。 毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和

7、KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记 。其中，GS115茵株具有AOX1基因， 是Mut， 即甲醇利用正常型 ； 而KM71菌株的AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型 ，两种菌株都适用于一般的 酵母转化方法。Pichia.pastoris酵母菌体 内无天然质粒 ，所以表达载体需与宿主染色体发生 同源重组， 将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达5包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。 表达载体都是 穿梭质粒， 先 在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载体还 需带有信号肽序列。毕赤酵母表达系统有多种分泌型表

8、达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效 分泌表达。胞外表达需要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进 入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用pPICZ a A质粒，其信号肽来自酿酒酵母的a-交配因子(a-factor)，能很好的达到以上的要求。并且作为新 一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因给我们筛选转化子的工作带来很大的便利1、2。pPICZaA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒 ，它的主要特点简介如 下： 具有强效可调控启动子AOX1(alcohol o

9、xidase，醇氧化酶) ；价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，10*D20%Dextrose葡萄糖）保存期为 1 年。200g 葡萄糖溶于 1000ml 水 具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDZ平板上生长的转化子中， 100 都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程5。在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZ a A的大 肠杆菌转化子，不必另外使用Amp，经济而又简便；。 在表达载体A0X1 5端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多 克隆位点下游有A0X1

10、 3端终止序列； 分泌效率强的信号肽a-factor.Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为 广泛的酵母表达系统，其主要的优点有： 醇氧化酶可调控的强启动子 ，能高密度发酵， 重组蛋白表达量高。 外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在 。同时，高效分泌 表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但 提高表达蛋白的活性，而且，有利于产物的纯化。一毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制11各种母液的配制10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4C保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，

11、溶于1000ml水中，过滤除菌。500*B（0.02%生物素Biot in）4C保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。100*H（0.4%Histidine组氨酸）4C保存 保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于10*D20%Dextrose葡萄糖）保存期为 1 年。200g 葡萄糖溶于 1000ml 水100ml水中，（加热至50C以促进溶解），过滤除菌。中，灭菌15min或过滤除菌10*M（5%Methanol甲醇）保存期为 2 个月。将 5ml 的甲醇与 95ml 水混匀，过滤除菌。10*GY（10%Glycerol甘油） 保存期为 1 年以上。将 100m

12、l 甘油和 900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。100*AA（0.5% of each Ami no Acid，各种氨基酸）4C保存 保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶 于100ml水中，过滤除菌。1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶 液 132ml 与1mol/L 的 KH2PO4 溶液 868ml 混匀，其 pH 为 6.0 ，如需调节 pH ，则使用 磷酸和氢氧化钾调节pH。1.2常用溶液及缓冲夜1.2.1碱裂解法抽提质粒DNA 所用溶液：溶液I:

13、50mmol/ L glucose,100mmol/ L EDTA,25mmol/ L TrisHCI （pH 8.0）溶液U:0.2mol/L NaOH,1%SDS（临用时配制）溶液川：29.44g KAc,11.5ml Acetic acid，力口ddH2O至100 ml。4C保存。1.2.2 10%甘油 （Glycerol ）:将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为 1 年以上。1.2.3 Rnase-H2O:1ul Rnase加入 1ml 灭菌 dd H2O。4C保存。1.2.4 TE缓冲液：10mmol / Tris-CI(pH 80)，lmmol / L

14、 EDTA(pH 8.0)1.2.5 STE缓冲液：0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)1.2.6 SCE缓冲液：1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L柠檬酸钠 ，10mmol / L EDTA1.2.7 1M potassium phosphate bufferpH6.0132 ml 1M K2HPO4868 ml 1M KH2PO41.2.8 50X TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH8.0242 g Tris57.1 mlAcetic Acid37.2 gEDTA毕

15、赤酵母表达的培养基配制52.1 LB(LuriaBertani）培养基：TryptonYeast Extract0.5NaClPH 7.0制作平板时加入2 %琼脂粉。121C高压灭菌20min。可于室温保存。 用于培养pPICZaA原核宿主菌TOP10F时可加入 Zeocin 25ug / ml2.2 LLB(Low Salt LB)培养基：TryptonYeast Extract0.5PH 7.0制作平板时加入 2 %琼脂粉。121C高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZaA 原核宿主菌 TOP10F 时，加入 Zeocin 25ug / ml，可以 4C条件下保存 12

16、周。2.3YPD (又称 YEPD )Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone DextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基)Trypton2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin100卩g/ml液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4C可保存几个月。 加入Zeocin 100ug /ml，成为YPDZ培养基，可以4C条件下保存12周。2.4 YPDS + Zeocin培养基( Yeast Extract Peptone Dextrose Mediu

17、m)：yeast extract1%peptone2%dextrose (glucose)2%sorbitol1 M+agar2%NaCl0.5+ Zeocin100卩g/ml不管是液体丫PDS 培养基，还 YPDS+ Zeocin培养基，都必须存放4C条件下，有是效期12周2.5 MGYMinimal Glycerol Medium（最小甘油培养基）（ 34%YNB ； 1%甘油； 4*10-5% 生物素）。将 800ml 灭菌水、 100ml 的 10*YNB 母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4C保存，保存期为2 个月。2.6 MGYHMinimal Gl

18、ycerol Medium + Histidine（最小甘油培养基+ 0.004%组氨酸）在 1000ml 的 MGY 培养基中加入 10ml 的 100*H 母液混匀，4C保存，保存期为 2 个月。2.7RDRegeneration Dextrose Medium（葡萄糖再生培养基）（含有： 1mol/L 的山梨醇； 2%葡萄糖； 1.34%YNB ；4*10-5% 生物素； 0.005% 氨基酸）1.将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2.冷却后于45C水浴；3.将 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB；2ml 的 500*B；10ml 的 100*AA 等母液

19、和 88ml无菌水混匀，预热至45C后，与步骤2的山梨醇溶液混合。4C保存。2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine（葡萄糖再生培养基+ 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入 10ml 的 100*H 母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与 RD 相同。4C保存。2.9 RD及RDH平板的制备1.将 186g 的山梨醇和 1520g 琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60C水浴；2.参照 RD/RDH 液体培养基配制的步骤 4，将 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB；2ml

20、的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45C后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.迅速制备平板。4C可保存数月。2.10 RD及RDH的TOP琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）1.将186g的山梨醇和7.510g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60C水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的1 0*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水 混匀，预热至45C后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该TOP

21、琼脂置于45C水浴冷却、保温，备用。2.11 MD与MDHMinimal Dextrose Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培养基+（0.004 %组氨酸）（含有：1.34%YNB；4*10-5%生物素；2%葡萄糖）1.100ml 的 10*YNB ； 2ml 的 500*B 和 100ml10*D 母液，用 800ml 的无菌水定容至1000ml即可；2.如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入1520g的琼脂。4C可保存数月2.12 SOC培养基：TryptonlYeast Extract0.5NaCl0.05Gl

22、ucose (1mol / L)2%121C高压灭菌20min，冷却后，4C保存三主要试验环节的操作3.1酵母菌株的分离纯化接种GS115于5ml YPD液体培养基，30C,200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30C培养48小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD 平板，4C保存。3.2 pPICZaA原核宿主菌TOP10F的活化培养TOP10F做为菌种保存在70C条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。接种 TOP10F 于 5ml LLB (加入 25ug / ml Zeocin )中，37

23、C,200 rpm，培养 1618小时。3.3毕赤酵母表达的试验方法3.3.1线状质粒DNA的脱磷酸化处理为了防止载体质粒DNA 的自身环化， 用小牛肠碱性磷酸酶 ( CIP )处理酶切后的质粒DNA，具体操作如下： 建立反应体系：线性化的质粒35ul10 x CIP buffer4ulCIP1ulddH2O5ultotal45ul在PCR仪上控制反应温度(加石蜡油封闭)，37C，15 min;50C，15 min56C，30 min(灭活)。在56C未开始前停止，加入proteinse K，用于灭活CIP，加入试剂如下：反应物45ul10 x EDTA（pH 8.0）7ulproteinse

24、 K5ulddH2O6ultotal 70ul 纯化使用 QIAquick spin kit ，按照 2.2.3.3 步骤进行， 20 ul 灭菌ddH2O 洗脱纯化产物。进行1琼脂糖凝胶电泳，120 V， 观察纯化结果，并大约估计 DNA浓度。3.3.2 E.coli TOP10F 感受态细胞的制备及转化取10 ul TOP10F菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37C,200rpm,1618小时。取100 ul菌液接种于200 ml液体LB培养基中。37C,200 rpm，培养1618小时。 灭菌500 ml离心管，4C,4000 rpm,20 min。得菌体沉淀。弃上清，

25、菌体用10甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml液体用于重悬菌体。10 x 5 SDS7ul 从制得的感受态细胞中，取200 ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul， 混匀，不要产生气泡，在冰上放置5 min。 将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。 使用电击穿孔仪进行转化，设置为 电压2500 V，时间5 ms。 电击后， 往电击杯中加入800ul SOC培养基， 冲洗出菌体， 转移至灭菌1.5 ml EP管中。37C,150rpm，轻摇4560 min。 取全部均匀涂布于含Zeocin 25 ug/ml的LLBZeocin平板上，正放，待涂布 液不在

26、流动，37C培养1216小时。*注：设空载体做对照3.4毕赤酵母电转化方法3.4.1菌体的准备：1.挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30C、250300r/min培养过夜；2.取100500口1的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，2830C、250300r/min培养过夜，至OD600达到1.31.5；3.将细胞培养物于4C,1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀 重悬；4.按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5.按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6.按步骤3

27、离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；7.备注：可将其分装为80口1一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2 周之内）。3.4.2电击转化：8.将520yg的线性化DNA溶解在510卩l TE溶液中,与80口1的上述步骤6所得 的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯 中；9.将电转化杯冰浴5min；10.根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的 电压、电流、电容等参数 ，按优化的参数，进行电击；11.电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀， 转至1.5ml的EP管中；12.将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每2

28、00600yl涂布一块平板；13.将平板置于30C培养，直至单个菌落出现 推荐：电压1.5kV;电容25卩F;电阻200Q。电击时间为410msec。3.5 Pichia酵母表达直接 PCR 鉴定重组子的方法3.5.1模板的处理：1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）;2.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用 Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引 物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）;3.用半根灭菌的牙签 （节约，而且好用）挑取菌落 ，在PCR管中涮以下，放入一 个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管

29、编号;4. PCR扩增，1agarose电泳;5.对于PCR扩增显现特异性条带的克隆， 把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，812小时后提质粒，酶切鉴定确认。注意：本试验方法应用在需要挑取的克隆较多（也就是克隆效率低），使用PCR初筛可以使工作量大为降低。3.5.2 PCR反应体系：以TaKaRa Taq DNA聚合酶反应为例：组分50卩I体系20卩I体系10 xReaction Buffer 5.0卩I 2.0口I25mmol/L MgCI2 3.0卩I 1.2卩I2.5mmol/L dNTPs 5.0卩I 3.0卩lPrimer 1（10卩mol/L）

30、2.5I 1.0IPrimer 2（10卩mol/L）2.5I 1.0口IddH2O 31.5匕I 12.6匕ITaq DNA聚合酶0.5口l 0.2iTOTAL 50.0 ii l 20.0卩l3.5.3 PCR反应条件：初始变性94C4min变性94C30s 34个循环退火5054C30s延伸72C30s结束延伸72C10min保存4C3.6毕赤酵母基因组提取方法接种重组和空质粒转化子于5ml YPDZ培养基，GS115菌于YPD培养基作对照，30C,培养1618小时。室温下，1500 g离心5-10min收集菌体 100 ulTE （ pH 7.0 ）重悬，加入 300 ul EDTA

31、（pH 8.0 ）， 0.07M Tris HCl， 3ul3-巯基乙醇，1ul Lyticase, 37C水浴 30 min。10000g离心5 10min，取沉淀，加90ul TE重悬。200ul饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s，取上层水相。 加入两倍体积无水乙醇以及1/10 体积的 NaAC , -20C放置 30min ;10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；干燥后，加入151的TE或H2O溶解，-20C备用。3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验1.挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30C/25

32、0-300 rpm培养至OD600 = 2-6 (16-18 h)2.室温下15003000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右（约100200ml）；3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30C/250-300 rpm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.51.0%;5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1 ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心23min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间 点一般取：0、6、12、24、36、48、60、7

33、2、84和96h；6.对分泌表达， 分离样品的上清液； 对胞内表达， 分离样品的菌体沉淀， 带检测 样品用液氮或干冰速冻后，于-80C保存备用；7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。3.7 Muts表型重组酵母的诱导表达实验1.挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30C/250-300 rpm培养至OD600 = 2-6 （16-18 h）；2.室温下 15003000g 离心 5min ，收集菌体，用 1/5 到 1/10 原培养体积的 MM、BMM或BMMY重悬菌体（约1020ml）；3

34、.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30C/250-300 rpm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100% 甲醇至终浓度为0.51.0%；5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1 ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心23min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、24、48、72、96和120h；6.对分泌表达， 分离样品的上清液； 对胞内表达， 分离样品的菌体沉淀， 带检测样7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达四试验的注意事项4.1信号肽识

35、别位点的设计以质粒pPICZaA为例。在利用PCR反应在外源基因两端引入酶切位点的试验中。 如果质粒pPICZaA双酶切中丢失了KEX2蛋白酶的酶切位点Lys-Arg,应该在上游 中，增加了编码Lys、Arg的密码子AAA、AGA。酵母细胞膜中中的KEX2蛋白酶是a-factor信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点Lys-Arg,通过对信号肽的切割使基因表达产物释放至胞外。4.2 PCR产物酶切保护碱基的设计利用PCR转换酶切位点，通过P3、P4两引物的扩增在rhEGF的两端加上XhoI、XbaI的识别位点和5个保护碱基。根据限制性核酸内切酶的工作原理，内切酶首先需要结合到核苷酸序列上，并在上

36、面进行滑行，直至识别到酶切位点，为了能使内切酶有效的结合到序列上以利于其的有效加工。在利用PCR进行酶切位点转换的时候，通常应在5端限制酶位点外再加3个保护碱基GC:6，防止引物合成中因为合成效率和纯化问题而导致的酶 切位点的残缺。核苷酸保护碱基之为了保证限制型内切酶的工作效率，在其识别位点的两侧应该保证 一定的旁侧序列，换言之，识别位点是限制型内切酶识别并特异性切割底物的必要而 不充分的条件。鉴于NEB(NewE ngla nd Biolabs)公司在限制酶领域的总体研究 水平和对保护碱基方面的独到理解，在设计引物时可以参照NEB 公司的产品目录后进行7，但是，一些不常面的附录：Cleava

37、ge to the end of DNA fragme nts 用的酶或虽有推荐的保护碱基序列但酶切效率仍不高的酶还是很难设计保护碱基。本次实验中，根据美国基因动力实验室文献的报道8；XbaI、NheI和SpeI位点5 端保护碱基须在5个左右才容易被酶切割， 以及一些前人的经验总结， 我们在设计引 物时在识别位点5端，设计了5个保护碱基。以保证较高的酶切效率。4.3高保真DNA 聚合酶的使用Vent DNA 聚合酶是从高温嗜热菌中分高出的高保真 ( High Fidelity)耐高温DNA 聚合酶，能纠正DNA扩增中产生的错误， 而传统的 Taq DNA 聚合酶，Tth DNA 聚合 酶及其变

38、体AmpliTaq，KlenTaq等都无3至5纠错功能，因此在扩增时出现碱基 错配的机率为2.1x104。这对于大批量的PCR产物而言，并不是十分严重的问题，因 为又同样错误的DNA分子仅占全部合成的DNA分子群体的极少一部分。但是，如果PCR扩增的DNA片段是用于分子克隆，那么这就是件值得重视的事情，因为此种 分子含有一个或数个错误掺入的核苷酸，那么在该克隆中的所有克隆DNA都将带有同 样的“突变”。将会导致严重的后果9。具有校正功能的DNA聚合酶还有Pfu，DeepVent，Pwo，UlTma等，Pfu是其中出 错率最低的，比Taq DNA聚合酶低10倍 。在本论文中，为了减少hEGF在P

39、CR过程 的错误扩增，在人工合成hEGF的过程中使用了Vent DNA聚合酶。随着PCR技术的不断发展成熟(扩增长度、保证性、产量和特异性等)，质粒构建 过程的大多数细胞内的DNA复制将被PCR这一细胞外的DNA复制所代替，质粒构建 效率将有质的飞跃。4.4密码子的偏好性的原则 酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主 在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析外源基因表达的规律有重要意义,也为改造 外源基因或改造宿主细胞提供依据10、11。4.5线性化及采用电转化的原因：在pPICZ a A-EGF电转整合入GS115的时候，因为需要比较高的转染率，我们对其 用限制性

40、内切酶SacI进行线性化的处理。细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点。 因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理。 这种处理的目的： 防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活； 让同源重组以指定的方式发生。4.5乙醇沉淀法的问题主要步骤如下：1)酶切体系(80ul)中2倍体积的无水乙醇加 1/10 体积的 PH5.2 NaAC ，混匀2)-20C20分钟沉淀3) 13200rpm，20min，离心后弃上清4) 75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心 5min，弃上清5) 37度烘箱至无乙醇气味(或是用摇床的

41、出风口吹出的暖风吹)。6) 20ul ddH2O重溶如果想提高转化效率，可以稍微做一些改进：1.还是用酚抽一下，去除内切酶；2. 75%乙醇应洗两遍，尽可能去除盐离子，防止电转化杯被击穿，同时可提高效率；3.在沉淀时， 如用终浓度2.5M的醋酸钠+2.5倍体积的无水乙醇， 可沉淀几乎所有的DNA，但需要用75%的乙醇认真的洗两遍。4.6酶切的总结影响重组质粒构建效率的最关键步骤在于酶切，不管是否是定向克隆还是非定向克隆。酶切的关键在于切干净，彻底的酶切反应是成功的一半，特别是载体的酶切 ，尤其 是双酶切。双酶切一般是先反应低盐buffer的、后反应高盐buffer的，如果低盐buffer的酶在高盐buffer的酶的反