高效液相色谱

1、第三章第三章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析High performance liquid chromatography第一节第一节 概概 述述 GC只适合分析只适合分析较易挥发、且化学性质稳定较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用则适合于分析那些用GC难以分析的物质。难以分析的物质。 所以，所以，HPLC的应用范围远远超过的应用范围远远超过GC。 高效液相色谱法是继气相色谱之后，高效液相色谱法是继气相色谱之后，20世纪世纪70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。色谱技术。高效液相色谱法定义高效

2、液相色谱法定义 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵高压泵、化学化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：高压：150-350105 Pa 高效：大于高效：大于3万塔板万塔板/米米（GC：103塔板塔板/米）米） 高灵敏：高灵敏：10-9g （紫外检测）、（紫外检测）、10-11g （荧光检测）（荧光检测）高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法与

3、经典液相色谱法的比较 经典液相色谱法经典液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法粒径粒径(m)75-6003-50（常用（常用5-10）柱前压力柱前压力(atm)0.01-1.020-300分析时间分析时间 (h)1-200.05-1.0色谱柱长度色谱柱长度(cm)50-2002-30柱效柱效(块块/m)2-50104-105样品用量样品用量(g)1-1010-6-10-2经典液相色谱法，流动相在经典液相色谱法，流动相在常压常压下输送，下输送，分析周期长。分析周期长。而高效液相色谱法流动相改为而高效液相色谱法流动相改为高压高压输送输送（最高输送压力可达（最高输送压力可达3.5 107Pa） 色谱

4、柱是用色谱柱是用小粒径小粒径的填料填充而成，从而使的填料填充而成，从而使柱柱效效大大高于经典液相色谱；大大高于经典液相色谱； 柱后连有柱后连有高灵敏度的检测器高灵敏度的检测器，可对流出物进行，可对流出物进行连续检测。连续检测。 因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。能高、自动化等特点。 所以称它为所以称它为高压、高速、高效高压、高速、高效液相色谱法。液相色谱法。HPLC在药物分析中的作用 药品质量标准在药物分析中，HPLC已成为对各类药物及其制剂进行鉴别、检查、杂质分离及含量测定的重要手段，以下以中国药典和美国药典为代表说明HPLC

5、在药品质量标准中的作用。中国药典含量主要测定方法统计/ %版本滴定分析法质量分析法分光光度法HPLCGC1953年版68.811.90001963年版68.211.36.93001977年版61.83.8922.3001985年版57.82.6428.01.170.291990年版52.12.2926.36.090.441995年版51.81.4228.98.010.572000年版47.61.228.017.80.6美国药典含量测定方法比较 （品种数）版本HPLCGCTLCUVIRFLAASNMRTI20版62682546921107221版363142698131727222版871157

6、15542171776578423版1188100449015578280324版138611113741414962775Atomic Absorption Spectroscopy 原子吸收光谱Nuclear Magnetic Resonance 核磁共振Infrared ray 红外光谱Fluorescence spectrum 荧光光谱TI 滴定分析法 药物分析研究方法药物分析研究方法 以我国分析试验室杂志中的药物分析综述统计分析见表19922000年分析试验室杂志药物分析论文统计 / %方法19921994199619982000UV27.727.128.517.616.2HPLC2

7、7.029.239.244.540.0GC12.810.37.69.78.0TLC13.416.612.216.121.4HPCE3.25.6电化学8.54.72.5其他10.611.410.09.08.8论文总数553923760870879HPCE 高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法高效液相色谱法与其他分离方法的比较高效液相色谱法与其他分离方法的比较项目分馏结晶提取经典柱色谱TLCGCHPLC分离效率低低低低高高高分离速度慢慢慢慢较快快快应用范围窄窄广广广较窄广样品用量多多多多少少少可否用于制备可可可可尚可可可可否用于痕量分析否否否否可可可分析鉴定可可否否可可可分析灵敏度低低-高高高 应用应

8、用 由于由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析， 因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。和医学等方面应用极为广泛。 如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析。醇、金属有机物等分析。第二节第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的影响色谱峰扩展及色谱分离的因素因素H=A+B/u+CuA=2dp液体流动

9、相的扩散系数很小液体流动相的扩散系数很小B0CuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n 两者H-u曲线的形状相似 HPLC的板高极小值比GC的极小值小一个数量级，说明液相色谱的柱效高 HPLC的板高极小值对应流速比GC的流速小一个数量级2. 对速率方程的讨论 选用选用细颗粒细颗粒填料可获高柱效填料可获高柱效 流 动 相 流 速 低 ， 有 利 于 达 到 高 柱 效流 动 相 流 速 低 ， 有 利 于 达 到 高 柱 效1ml/min 选用选用黏度小的流动相黏度小的流动相有利于提高柱效有利于提高柱效 甲醇 温度的影响温度的影响室温250C左右 液膜厚度的影响液膜厚度

10、的影响第三节第三节 HPLCHPLC主要类型与分离原理主要类型与分离原理一、一、 液液-固吸附色谱固吸附色谱 固定相固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是用的是510m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂； 流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。 应用：应用：对于对于异构体分离和族分离异构体分离和族分离是最有效的方法，是最有效的方法，如农药异构体分离，石油中烷、烯、芳烃的如农药异构体分离，石油中烷、烯、芳烃的分离。分离。 缺点是容

11、易产生不对称峰和拖尾现象。缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。p各组分的出峰顺序各组分的出峰顺序 极性极性较小较小组分，吸附力较弱，容易解吸，组分，吸附力较弱，容易解吸，先流出先流出。 极性极性较大较大组分滞留作用大，组分滞留作用大，后流出后流出。 二、二、 液液-液分配色谱液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的组分在固定相和流动相上的分配分配； 流动相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，对于亲水性固定液，采用疏水性流动相， 即流动相的极性小于固定液的极性（即流动相的极性小于固定液的极性（正相正相

12、），）， 反之，流动相的极性大于固定液的极性（反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相反相 ）。）。 参见参见P79表表3-2 固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液易流失，早期涂渍固定液，固定液易流失，较少采用；较少采用； 化学键合固定相化学键合固定相：（将各种不同基团通过（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。羟基上。C18柱（反相柱）。柱（反相柱）。三、离子交换色谱法三、离子交换色谱法原理原理 基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，中具有相同电荷的溶质离子

13、进行可逆交换，根据这些离子对交换剂具有不同的根据这些离子对交换剂具有不同的亲和力亲和力进进行交换达到平衡。行交换达到平衡。 如磺酸基和羧酸基可以用于阳离子的分离，季胺盐可以用于阴离子的分离。 smsmRXYRYXsmsmRXYRYX阳离子交换：阴离子交换：离子交换树脂上可以离解的离子和流动相中具有相同电荷的的溶质离子之间进行的可逆交换，根据这些离子对交换剂有不同的亲和力而被分离。以阳离子交换为例 样品阳离子以及流动相阳离子都与固定相交换基样品阳离子以及流动相阳离子都与固定相交换基团作用，样品离子不断地进入固定相，又不断地团作用，样品离子不断地进入固定相，又不断地被流动相阳离子交换而进入流动相，

14、被流动相阳离子交换而进入流动相， 在两相中达到动态平衡，不同的样品阳离子与交在两相中达到动态平衡，不同的样品阳离子与交换基团的作用力大小不同，换基团的作用力大小不同，电荷密度大的离子与电荷密度大的离子与交换基团的作用力大交换基团的作用力大，在树脂中的保留时间就长，在树脂中的保留时间就长，于是不同的离子相互分离。于是不同的离子相互分离。在离子色谱的基本组成中，重要的和与其他高效液相色谱不同的就是抑制器和电导检测器。离子色谱中发生的基本过程就是离子交换，因此，离子色谱本质上就是离子交换色谱。w 安装在安装在电导电导池之前池之前w 提高待提高待测测离子的离子的电导电导率率： ： 提高灵敏度提高灵敏度

15、Na+, Cl- H+, Cl-w 降低背景降低背景电导电导 (淋洗液淋洗液) : 减少噪音减少噪音Na+, HCO3- H2CO3Na+,OH-H2O二、离子色谱仪器淋洗液 泵色谱柱检测器 泵液分离 检测 记录F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-进样阀抑制器检测池进样 以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。凝胶色谱又常被称作凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱体积排斥色谱、空间排阻色谱。比固定相孔径比固定相孔径大大的溶质分子不能进入孔

16、内，迅速流的溶质分子不能进入孔内，迅速流出色谱柱。出色谱柱。比固定相孔径比固定相孔径小小的分子才能进入孔内而产生保留，的分子才能进入孔内而产生保留，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大，于是在固定相中停留（保留）的时间也就越长于是在固定相中停留（保留）的时间也就越长四、凝胶色谱四、凝胶色谱 凝胶过滤色谱（凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC）：）： 以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于法。主要适合于水溶性高分子的分离水溶性高分子的分离。 凝胶渗透色谱（凝胶渗

17、透色谱（gel permeation chromatography, GPC）：）： 以有机溶剂作流动以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子脂溶性高分子的分的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。的测定。 溶剂 自动进样器 HPLC色谱柱废液1.1.流程图流程图第四节第四节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪由高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统

18、离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。等五大部分组成。分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，柱子达到平衡而且基线平直。洗柱子，柱子达到平衡而且基线平直。用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器，最后和洗脱液一起排入废液缸。测器，最后和洗脱液一起排入废液缸。当有样品组分流过检测器时，检测器把组分浓度当有样品组分流过检测器时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来得转变成电信号，经过放大，用

19、记录器记录下来得到色谱图。到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。(1) 高压输液泵高压输液泵 A、主要部件之一，压力：、主要部件之一，压力：1535MPa。 B、应具有、应具有压力平稳压力平稳、脉冲小、脉冲小、流量稳定流量稳定、可调、耐腐蚀等、可调、耐腐蚀等特性特性2.主要部件主要部件(2)脱气装置脱气装置流动相流动相为什么要脱气为什么要脱气流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。 气泡进入检测器后会在色谱图上出现气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰尖锐的噪音峰。 气泡进入流

20、路或色谱柱中会使流动相的气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速变慢或出现流速不稳定流速不稳定，致使基线起伏。，致使基线起伏。 气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。 溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生值发生变化。变化。 脱气方法脱气方法离线超声波振荡脱气和在线真空脱气。离线超声波振荡脱气和在线真空脱气。超声波振荡脱气：超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器放入将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气超声水槽中脱气10-20min。 这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操

21、这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。作的要求，所以，目前仍广泛采用。真空脱气装置真空脱气装置 将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该管外有真空容器，真制造的输液管，该管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。入膜外而被脱除。 一般的真空脱气装置有一般的真空脱气装置有多条流路多条流路，可同，可同时对多个溶液进行脱气。时对多个溶液进行脱气。 为什么要进行梯度洗脱？在进行多成分的复杂样品的分

22、离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。 为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。 (3)梯度洗脱梯度洗脱 梯度洗脱操作在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。 定义：流动相中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相的配比和极性，以提高分离效果。 例如，甲醇-水40：60到45：55到50：50 优点：分离时间缩短，分辨能力增加，峰形改善梯

23、度洗脱装置梯度洗脱装置高压梯度高压梯度: 利用两台高压泵，利用两台高压泵，将两种不同极性的溶剂将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色混合室，混合后进入色谱柱。谱柱。低压梯度低压梯度: 一台高压泵一台高压泵, 通过通过比例调节阀比例调节阀,将两种或将两种或多种不同极性的溶剂多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高按一定的比例抽入高压泵中混合。压泵中混合。 混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置， (4) 进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作

24、状态， 通常使用耐高压的通常使用耐高压的六通阀六通阀进样装置，进样装置， 其结构如图所示：其结构如图所示：(5) 高效分离柱高效分离柱p 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm（常用（常用4.6mm或或3.9mm），柱长），柱长540 cm（常用（常用15cm或或25cm）。）。p 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。p 与与GC色谱柱不同。色谱柱不同。 a. 紫外检测器紫外检测器基于基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。见光具有吸收，且吸收强

25、度与组分浓度成正比。应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点：特点： 灵敏度高；灵敏度高； 线形范围高；线形范围高； 流通池可做的很小（流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积，容积 8L）；）； 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作。波长可选，易于操作。 (6) 检测器检测器紫外吸收检测器有三种类型：固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm或280nm紫外光。可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光光二极管阵列检测器photodiodearray detector（PDAD，PDA, DAD）：钨

26、灯和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。PDA 可以辅助定性。b. 荧光检测器荧光检测器（Fluorescence detector） 高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。化合物等有响应。 原理： 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。 荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。 有的有机化合物虽然本身不产生

27、荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。 溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积之和。之和。RIDRID是通用型的检测器，但是灵敏度不高。是通用型的检测器，但是灵敏度不高。RIDRID不能用于梯度洗脱。不能用于梯度洗脱。C.示差折光检测器示差折光检测器 原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化

28、与样品组分的浓度成正比。 绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RI是一种通用的检测方法。 虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。 在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。 D.电导检测器（电导检测器（conductivity detector, CD）原理： 基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。 电导检测器是离子色谱中必备的检测器。电导检测器的构成： 由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。蒸发光散射检测器E.蒸

29、发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ ELSD）ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成 色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质， 激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。 因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。 适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。 与示差折

30、光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。 电学和电化学检测器：安培检测器电导检测器库仑检测器介电常数检测器极谱检测器美国美国Waters公司公司 600E高效液相色谱仪高效液相色谱仪第五节第五节 液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相 1. 1. 液液- -液分配固定相液分配固定相 （1）全多孔型担体）全多孔型担体 由由氧化硅、氧化铝、硅藻土氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；等制成的多孔球体； 早期采用早期采用100m的大颗粒，的大颗粒， 存在裂隙，传质缓慢，使色谱峰展宽，已不多见。存在裂隙，传质缓慢，使色谱峰展宽

31、，已不多见。 现采用现采用10m以下的小颗粒，是由以下的小颗粒，是由nm级的级的硅胶微粒堆聚而成的全多孔小球；硅胶微粒堆聚而成的全多孔小球； 传质距离短，柱效高。传质距离短，柱效高。 是使用最广泛的高效填料。是使用最广泛的高效填料。 （2）表层多孔型担体）表层多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着一的玻璃微球，表面附着一层厚度为层厚度为1 2m的多孔硅胶。的多孔硅胶。 表面积小，柱容量低；表面积小，柱容量低； 将固定液机械地涂渍在担体上组成固定将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相。尽管选用的流动相与固定液不互溶，但相。尽管选用的流动相与固定液不互溶，但

32、在色谱过程中固定液仍会有微量在色谱过程中固定液仍会有微量溶解溶解。 以及流动相经过色谱柱的以及流动相经过色谱柱的机械冲击机械冲击，固，固定相会不断定相会不断流失流失。 70年代初发展了一种年代初发展了一种新型新型的固定相的固定相化化学键合固定相。学键合固定相。（3）化学键合固定相）化学键合固定相这种固定相是通过化学反应把各种不同的有机通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。这避免了固定液流失，改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，适用于分离几乎所有类型的化合物。 化学键合固定相化学键合固定相: 目前应

33、用最广、性能最佳的固目前应用最广、性能最佳的固定相（见定相（见P79表表3-2）；）； a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型：硅碳键型： SiC d. 硅氮键型：硅氮键型： SiN固定相类型固定相类型极性固定相：正相色谱极性固定相：正相色谱 以极性有机基团如胺基（以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（）、腈基（-CN）、醚基（）、醚基（-O-）等键合在硅胶表面制成的）等键合在硅胶表面制成的 非极性固定相：反相色谱非极性固定相：反相色谱是是C18

34、、C8和苯基键合相的填料，和苯基键合相的填料，反相色谱是当今液相色谱的反相色谱是当今液相色谱的最主要最主要分离模式。分离模式。使用条件为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.57.5（28）。太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。 化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；质快；（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；冲击；耐水、耐光、耐

35、有机溶剂，稳定； （4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。，可键合不同官能团，提高选择性。正相色谱法正相色谱法 反相色谱法反相色谱法 1.1.极性固定相极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.2.相对非极性流动相相对非极性流动相 正已烷、苯、氯仿正已烷、苯、氯仿 3.3.极性调节剂极性调节剂 醚、酮、醇、酸醚、酮、醇、酸 4.4.分离中极性和强极性化合物分离中极性和强极性化合物 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.5.组分流出顺序组分流出顺序 极性小先流出极性小先流出 1.1.非非极性固定相极性固定相 CC1818（简称（简

36、称ODSODS） 、CC8 8 2.2.极性流动相极性流动相 水水3.3.极性调节剂极性调节剂 甲醇、乙腈、四氢呋喃甲醇、乙腈、四氢呋喃4.4.分离非极性和极性较弱化合物分离非极性和极性较弱化合物 占整个占整个HPLCHPLC应用的应用的80%80%左右左右 5.5.组分流出顺序组分流出顺序 极性大先流出极性大先流出 液液分配色谱 2. 2.液液- -固吸附固定相固吸附固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：粒度：510 m； 二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相 1. 1. 流动

37、相特性流动相特性 流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况 2. 2. 流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分； 按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性； 常用溶剂常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。3. 3.

38、流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)4. 4. 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用）尽量使用色谱纯色谱纯试剂作流动相，防止微量杂质长期累试剂作流动相，防止

39、微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。柱子。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（5）应与检测器相匹配。当使用紫外检测器时，流动）应与检测器相匹配。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。相不应有紫外吸收。（4）黏度小些为好）黏度小些为好 否则造成传质速率缓慢，柱效下降。否则造成传质速率缓慢，柱效下降。第六节第六节 HPLC分离类型选择分离类型选择要正确地选择色谱分

40、离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围色谱方法的主要特点及其应用范围。 选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相是样品的相对对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。化学性质。一、相对分子质量一、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在对于相对分子质量较低（一般在200以以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择品，可以选择气相色谱

41、法气相色谱法进行分析。相对分进行分析。相对分子质量在子质量在200 2000的化合物，可用液固吸的化合物，可用液固吸附、液附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于子质量高于2000，则，则可用空间排阻色谱法。可用空间排阻色谱法。二、溶解度二、溶解度 水溶性水溶性样品最好用样品最好用离子交换色谱离子交换色谱法和法和液液液分配液分配色谱法；色谱法； 微溶微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离的化合物，也可用离子交换色谱法离子交换色谱法； 油溶性油溶性样品或相对非极性的混合物，可样品或相对非极性的混合物，可用用液液-

42、固固色谱法。色谱法。三、化学结构三、化学结构 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色配色谱法；对

43、于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。谱法。生物化学和生物工程医药食品分析环境分析精细化工第七节第七节 HPLC的的应用应用 HPLC在各领域的主要应用在各领域的主要应用应用领应用领域域分析对象举例分析对象举例环境常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分。农业土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有机成分。石油烃类族组成、石油中微量成分。化工无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、化妆品、染料。材料液晶材料、合成高分子材料。食品无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原

44、微生物、霉菌毒素、多核芳烃。生物氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。医药人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成分。 1. 1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(37 50 m) 流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径) 检测器：示差折光检测器检测器：示差折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。液固吸附色谱液固吸附色谱2. 2. 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 固定

45、相：十八烷基硅烷键合相固定相：十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器反相色谱，梯度洗脱反相色谱，梯度洗脱 液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件四、制备型液相色谱四、制备型液相色谱 preparativ

46、e liquid chromatography 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱（内径半制备柱（内径8mm，长度，长度15 30cm），一次制备量），一次制备量.1mg；1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下

47、降一半或容量因子k降降低低10%为宜。为宜。2. 2. 液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率；使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离为主成分（富集）后，再次分离制备。制备。 3. 3. 制备型液相色谱制备型液相色谱 制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集

48、器。进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱制备柱：内径内径2050mm，柱长，柱长50cm。液相色谱与气相色谱的比较液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用基本概念和基本理论基本一致。 液相色谱所用的仪器设备和操作条件与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：（1 1）应用范围不同应用范围不同 GC仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，只只有大约有大约20%的有机物能用气相色谱分析的有机物能用气相色谱分析； HPLC则不受样品挥发度和热稳定性的限