扬州大学测试中心质谱仪器介绍PPT课件

1、扬州大学测试中心质谱仪器介绍扬州大学测试中心质谱仪器介绍 生物质谱平台生物质谱平台 色色质质谱机组谱机组王郁杨王郁杨 博士博士 2014年年03月月15日日生物质谱生物质谱 蛋白质组研究的关键技术蛋白质组研究的关键技术 基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI） LC MALDI TOF/TOF分析与分析与AB SCIEX TOF/TOF 5800 系统系统 电喷雾电离电喷雾电离（electrospray ionization, ESI） UHR-TOF maXis 超高分辨飞行时间质谱仪超高

2、分辨飞行时间质谱仪LC MALDI TOF/TOF分析与分析与AB SCIEX TOF/TOF 5800 系统系统5800 MALDI TOF/TOF 串联飞行时间质谱主机串联飞行时间质谱主机Tempo LC MALDI 点样系统点样系统Mascot 2.3 结合结合Mascot Deamon搜索引擎搜索引擎ProteinPilot 4.0 蛋白分析工具蛋白分析工具MALDI 的原理的原理 待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收为晶体或半晶体，用一定波长的

3、脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。 常用的常用的 MALDI 基质基质Matrix Application 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)2,5-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸Small molecules, small peptides, nucleotides, oligonucleotides, oligosaccharides 3,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (SA) 3,5-二甲氧基羟基肉硅酸二甲氧基羟基肉

4、硅酸(反式反式)Large peptides, whole proteins, glycoproteins, lipids a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 腈基腈基羟基肉硅酸羟基肉硅酸Peptides, proteins, lipids, nucleotidesMALDI 基质应具有的特性基质应具有的特性 能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间的相互作用(如形成共结晶); 能溶解于可溶解样品分子的溶剂; 在真空状态下是稳定的; 可吸收激光,既与激光形成共振吸收; 可激发样品分子离子化. 是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间

5、不同是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比而被检测即测定离子的质荷比 (m/z) 与离子的飞行时间成正比。与离子的飞行时间成正比。反射飞行时间质量检测器反射飞行时间质量检测器飞行时间分析器飞行时间分析器MALDI-TOF/TOFMALDI 源可以电离分子质量为源可以电离分子质量为102106 Da 的生物分子并用于质谱分的生物分子并用于质谱分析。析。MALDI产生的离子采用飞行时间质量分析器（产生的离子采用飞行时间质量分析器（TOF）来检测，）来检测，因此因此适用于蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的测定。适用于蛋白质、多肽、核酸和多糖等生

6、物大分子的测定。通过通过第一级第一级TOF选择特定多肽和蛋白选择特定多肽和蛋白，而后送入碰撞池进行裂解，再，而后送入碰撞池进行裂解，再进入进入第二级第二级TOF进行序列和修饰等结构解析进行序列和修饰等结构解析，完成蛋白质的精确鉴定。，完成蛋白质的精确鉴定。根据测定蛋白质酶解后的根据测定蛋白质酶解后的肽质量指纹图谱、肽序列标签以及一级质谱肽质量指纹图谱、肽序列标签以及一级质谱（MS）结合串联质谱（）结合串联质谱（MS/MS）法去检索核酸或蛋白质序列库，可法去检索核酸或蛋白质序列库，可达到对蛋白质的达到对蛋白质的快速鉴定和高通量筛选快速鉴定和高通量筛选。Tempo LC MALDI 点样系统点样系

7、统数据库检索数据库检索 Mascot 2.3 结合Mascot Deamon搜索引擎 ProteinPilot 4.0 蛋白分析工具 基于凝胶分离的蛋白质点或者条带的鉴定基于凝胶分离的蛋白质点或者条带的鉴定 (2-DE,DIGE,Co-IP, GST pull down.) 运用质谱进行定量的蛋白质组分析技术运用质谱进行定量的蛋白质组分析技术 (iTRAQ,SILAC,ICAT.) 生物大分子的分子量分析（生物大分子的分子量分析（1000)与高聚物分子与高聚物分子(基质合适基质合适)分析分析MALDI 源生物质谱技术平台的应用双向电泳切胶酶解肽提取点靶5800数据采集进靶799.01441.8

8、2084.62727.43370.24013.0Mass (m/z)4829.80102030405060708090100Final - Shots 750 - qinghua; Run #7; Label C11936.02322030.05491528.81702007.97522292.24291656.87952682.45701970.99132326.12131965.04263036.51591141.62501645.93053362.51272357.1841889.49262665.4473一级图谱9.0492.6976.21459.81943.42427.0Mass (

9、m/z)8769.40102030405060708090100Final - Shots 1050 - NWFU20080321; Run #3; Label G30 Prec = 2298.1658 114.1294639.25851661.88341021.47001350.7125291.14471136.4447892.4456605.25101465.73941732.91431249.74602009.0321874.5229421.0647228.145070.1026111.0112.6114.2115.8117.4119.0Mass (m/z)8769.4010203040

10、5060708090100Final - Shots 1050 - NWFU20080321; Run #3; Label G30 Prec = 2298.1658 114.1294115.1286113.1072112.0890二级图谱二级匹配图谱数据库检索FEFAPVDTIDEEGTNTVK 115/1141.0502匹配肽Glutathione S-transferase 115/1141.0054鉴定的蛋白质Western-bloting 验证ProteinPilotSoftware /MASCOT2-DE 路线路线适用于质谱的染色方法适用于质谱的染色方法荧光染色（荧光染色（SYPRO

11、 Ruby protein gel stain）考马斯亮兰染色（考马斯亮兰染色（Bio-Safe Coomassie colloidal 250 stain） 银染（银染（Silver Stain Plus stain）一级图谱一级图谱二级图谱二级图谱Mascot DeamonTrypsin digestion799.01441.82084.62727.43370.24013.0Mass (m/z)4829.80102030405060708090100Final - Shots 750 - qinghua; Run #7; Label C11936.02322030.05491528.817

12、02007.97522292.24291656.87952682.45701970.99132326.12131965.04263036.51591141.62501645.93053362.51272357.1841889.49262665.44739.0492.6976.21459.81943.42427.0Mass (m/z)8769.40102030405060708090100Final - Shots 1050 - NWFU20080321; Run #3; Label G30 Prec = 2298.1658 114.1294639.25851661.88341021.47001

13、350.7125291.14471136.4447892.4456605.25101465.73941732.91431249.74602009.0321874.5229421.0647228.145070.1026LC-MALDISDS-PAGE免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-IP）GST pull down蛋白质与核酸相互作用鉴定蛋白质与核酸相互作用鉴定iTRAQ 路线路线iTRAQ + LC-MALDI + 5800 + ProteinPilot样品标记试剂数据分析软件数据采集质谱液相分离点靶系统iTRAQ试剂LC-MALDI液相点靶系统AB SCIEX TOF/TOF 5800同位素相对

14、标记与绝对定量技术同位素相对标记与绝对定量技术ProteinPilot使用Paragon算法同时搜索几百种种生物修饰及其它修饰、遗传变异、以及未预期的裂解方式，不会增加出现假阳性的几率，也不会延长搜索时间或是增加多级分析的复杂性。使用嵌入式Pro GroupTM 算法进行蛋白group分析，可区分蛋白异构体，蛋白子集，并抑制假阳性。定量工作流程 - 为iTRAQTM、ICAT和 SILACTM试剂工作流程提供优化支持，包括4标（4plex）、8标（8plex）试剂，和用于生物标志物发现及验证的新型试剂mTRAQ。使用反库（decoy）搜索进行自动化且严密的假阳性率（False Discover

15、y Rate，FDR）分析，可为您的结果提供高级别的质量控制。 标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”； 细胞处理、裂解、提取蛋白质； 等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色； 割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。细胞代谢标记（细胞代谢标记（SILAC）生物大分子的分子量分析生物大分子的分子量分析BSA某蛋白聚合体某蛋白聚合体MALDI 样品基本要求样品基本要求 磷酸盐缓冲液 50 mM 重碳酸铵 30 mM Tris buffe

16、r 100 mM 胍 (盐酸盐, 硫酸盐) 1 M Triton 0.1% SDS 0.01% 碱金属盐 1 M 甘油 50000 ( ESI+, m/z=1222 )； 45000 ( ESI-, m/z=1334)MS质量准确度：优于0.8ppm (全扫描，ESI+, m/z=1222，内标校正)优于2ppm (全扫描，ESI+, m/z=1222，外标校正)MS/MS质量准确度：优于2ppm (外标校正)同位素丰度比：平均丰度比误差小于2% (调谐标样)扫描方式：一级质谱全扫描(MS)，二级质谱全扫描(MS/MS)电喷雾源电喷雾源(ESI源源) 利用高电场使质谱进样段的毛细管柱流出的液滴

17、带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库伦斥力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈雾滴状，这时的液滴表面电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。仪器功能及附件：仪器功能及附件：1) 离子源：配有ESI电喷雾电离源、APCI大气压化学电离源、nanoESI纳升电喷雾电离源2) 戴安公司U3000高效液相色谱仪，配有DAD二极管阵列检测器，自动进样器，柱温箱3) EASY-nLC纳升液相色谱仪应用范围：应用范围： 用于小分子有机化合物的定性分析，可提供精确质荷比和同

18、位素丰度，推算分子的原子组成；用于中等极性和强极性大分子物质的定性分析，进行蛋白质组学等研究。优点：高采样速率、高分辨率、高质量准确度、高质量数优点：高采样速率、高分辨率、高质量准确度、高质量数Multiply Charged IonsESI spectrum of HEW Lysozyme（溶菌酶）溶菌酶）MW = 14,305.14大分子样品会生成带多种电荷大分子样品会生成带多种电荷 (from 2 to 20 )的样品离子的样品离子A亚型亚型MW= 18363.5024B亚型亚型MW=18277.4748A亚型亚型+B亚型亚型ESI图谱可以灵敏地反映蛋白质的构造图谱可以灵敏地反映蛋白质的

19、构造Native AzurinDenatured Azurin 大部分折叠、拼接或复合的蛋白质的质谱是非高斯分布大部分折叠、拼接或复合的蛋白质的质谱是非高斯分布 的，在图谱上只能观察到少量的峰，代表较高的的，在图谱上只能观察到少量的峰，代表较高的m/z m/z 值。值。 变性或变性或open form open form 蛋白质蛋白质/ /多肽较容易离子化，其谱图是多个高斯分布的峰。多肽较容易离子化，其谱图是多个高斯分布的峰。胶和液相杂合分离路线胶和液相杂合分离路线Agilent 1200-6460 QQQ应用范围：应用范围：化工产品的纯度分析与杂质分析化工产品的纯度分析与杂质分析食品中农药兽

20、药残留检测（瘦肉精、抗生素食品中农药兽药残留检测（瘦肉精、抗生素）环境污染物检测（水中的藻毒素环境污染物检测（水中的藻毒素）药物的代谢物分析药物的代谢物分析氨基酸、多肽的定性定量氨基酸、多肽的定性定量主要技术指标：主要技术指标：质量范围：m/z 53000；质量稳定度：+/- 0.1amu / 8hours；质谱功能：MS，MS/MS质量准确度：+/- 0.1amu；分辨率：单位质量分辨；动态线性范围：106；扫描速率：10,000amu/secMRM灵敏度：ESI+ ：1pg (1.6 fmol) 利血平 信噪比 1000 1扫描方式：多反应监测(MRM)、全扫描(Full Scan)、母离子扫描、子离子扫描、中性丢失扫描、选择离子扫描 仪器名称仪器名称生产厂家生产厂家型号型号质谱类型质谱类型主要应用主要应用气质联用仪气质联用仪ThermofisherTrace GC DSQ II四级杆四级杆有机化合物的定性和定量有机化合物的定性