酶联免疫分析法

1、2021/8/51第七章第七章 酶联免疫分析法酶联免疫分析法2021/8/52第第七七章章 酶联免疫分析酶联免疫分析法法 基本要求：基本要求： 了解免疫分析发展史，掌握抗原、抗体和免疫反应的了解免疫分析发展史，掌握抗原、抗体和免疫反应的原理，了解免疫分析法的分类，熟悉酶标记免疫分析原理，了解免疫分析法的分类，熟悉酶标记免疫分析法中使用的酶，熟悉法中使用的酶，熟悉ELISAELISA的原理，掌握的原理，掌握ELISAELISA的固相的固相载体、包被与封闭、稀释液、洗涤液、酶反应终止液载体、包被与封闭、稀释液、洗涤液、酶反应终止液及及ELISAELISA法常用酶的底物系统，掌握法常用酶的底物系统，

2、掌握ELISAELISA的酶联方法的酶联方法和试验方法，熟悉和试验方法，熟悉ELISAELISA反应条件的选择，掌握反应条件的选择，掌握ELISAELISA的定量计算，了解的定量计算，了解ELISAELISA的灵敏度提高途径，熟悉的灵敏度提高途径，熟悉ELISAELISA放大系统。了解化学发光分析的原理，熟悉化放大系统。了解化学发光分析的原理，熟悉化学发光剂的种类，熟悉化学发光酶联免疫分析常用的学发光剂的种类，熟悉化学发光酶联免疫分析常用的标记酶和发光增强剂，熟悉生物发光酶联免疫分析常标记酶和发光增强剂，熟悉生物发光酶联免疫分析常用的生物发光反应体系。用的生物发光反应体系。2021/8/53第

3、第七七章章 酶联免疫分析酶联免疫分析法法第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第二节第二节 光度酶联免疫分析光度酶联免疫分析第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析2021/8/54第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述一、一、免疫分析免疫分析1 1、免疫分析发展史、免疫分析发展史 免疫分析免疫分析（ImmunoassayImmunoassay，IAIA）是利用）是利用待测物质待测物质（抗（抗原或抗体）与其原或抗体）与其相对应物质相对应物质（抗体或抗原）之间（抗体或抗原）之间专一专一特异性反应特异性反应而建立起来的一种而建立起来的一种高选择性高选择性分析方法。分析方法。

4、免疫分析主要基于用免疫分析主要基于用抗体抗体（或抗原）作为选择性化学（或抗原）作为选择性化学试剂以分析试剂以分析测定抗原测定抗原（或抗体）及（或抗体）及半抗原半抗原。 宋代宋代 人工痘苗人工痘苗预防烈性传染病天花预防烈性传染病天花 19711971年年 第一届国际免疫学会议第一届国际免疫学会议 将免疫学与微生物将免疫学与微生物学分开发展成一门独立的学科。学分开发展成一门独立的学科。2021/8/55 “免疫（免疫（immunityimmunity）”一词源于一词源于 “immunitasimmunitas”，原，原意是免除税赋和差役。意是免除税赋和差役。 研究早期免疫学多集中在研究早期免疫学多

5、集中在抗体抗感染能力抗体抗感染能力研究。研究。 2020世纪中期以后，人们逐渐世纪中期以后，人们逐渐开始开始对各种抗原、微生物对各种抗原、微生物的作用进行研究，发展的作用进行研究，发展出出基础免疫学、临床免疫学、基础免疫学、临床免疫学、免疫学检测、医学免疫学等多个分支。免疫学检测、医学免疫学等多个分支。 现代免疫学将现代免疫学将“免疫免疫”定义为：定义为：机体机体对对“自己自己”和和“异己异己”识别识别、应答过程中所产生的、应答过程中所产生的生物学效应的总和生物学效应的总和，正常情况下是，正常情况下是维持内环境稳定维持内环境稳定的一种生理性功能。的一种生理性功能。第一节第一节 酶联免疫分析概述

6、酶联免疫分析概述2021/8/562 2、抗原、抗体与免疫反应、抗原、抗体与免疫反应 抗原抗原是能够引起免疫反应的分子。是能够引起免疫反应的分子。 免疫原性免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）指指诱导刺激免疫系统产诱导刺激免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞的能力生抗体或致敏淋巴细胞的能力。 具有免疫原性的物质称为具有免疫原性的物质称为免疫原免疫原（immunogenimmunogen）。 免疫反应原性免疫反应原性（immunoreactivityimmunoreactivity）或）或抗原性抗原性（antigenicityantigenicity），指能与相应抗体或

7、致敏淋巴细胞发），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。生特异性结合，引起免疫反应的性能。 具备上述两种特性的物质为具备上述两种特性的物质为完全抗原完全抗原，仅具有免疫反，仅具有免疫反应性的物质被称为应性的物质被称为半抗原半抗原（haptenhapten）。）。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/57 抗体抗体是能与抗原发生特异性结合的是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白免疫球蛋白。 所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗体白都是抗体。 例如例如无免疫活性的免疫球蛋白无免疫活性的免疫

8、球蛋白（如（如骨髓瘤蛋白骨髓瘤蛋白）就不就不是抗体，是抗体，尽管尽管其结构与抗体相似。其结构与抗体相似。 抗体主要存在于血清内抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中，但在其他体液及外分泌液中也有存在。也有存在。 抗原抗体分子抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性之间存在着结构互补性和亲和性，使得使得抗原与相应抗体之间抗原与相应抗体之间极极易发生结合反应，易发生结合反应，这种反应这种反应具具有有高特异性高特异性（即专一性即专一性）和）和可逆性可逆性。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/58 抗原、抗体发生如下免疫反应：抗原、抗体发生如下免疫反应： Ag+Ab A

9、g-AbAg+Ab Ag-Ab 该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学基本原理，其反应式为基本原理，其反应式为 式中：式中：AbAb为游离的抗体结合位点的浓度；为游离的抗体结合位点的浓度；AgAg为游为游离的抗原结合位点的浓度；离的抗原结合位点的浓度；Ab-AgAb-Ag为抗原为抗原- -抗体复合抗体复合物的浓度；物的浓度；k k1 1为正反应速率常数；为正反应速率常数；k k2 2为负反应速率常为负反应速率常数；数；K K为为反应平衡常数反应平衡常数（亲和常数亲和常数）。Kkk21AbAgAg-Ab第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分

10、析概述2021/8/59 这种抗原这种抗原- -抗体反应抗体反应既既可发生于体内（可发生于体内（in vivoin vivo），也），也可发生于体外（可发生于体外（in vitroin vitro）。）。 抗体主要存在于血清中，在抗原、抗体的检测中多采抗体主要存在于血清中，在抗原、抗体的检测中多采用血清做试验，所以用血清做试验，所以体外抗原体外抗原- -抗体反应抗体反应也称为也称为血清血清学反应学反应（serologic reactionserologic reaction）。）。 基于抗原基于抗原- -抗体反应的检测技术主要应用于以下几个抗体反应的检测技术主要应用于以下几个方面：方面：用已知

11、抗原用已知抗原检测未知抗体检测未知抗体；用已知抗体用已知抗体检测未知抗原检测未知抗原；定性或定量定性或定量检测检测体内体内各种大分子物质各种大分子物质；用已知抗体用已知抗体检测检测某些药物、激素等各种某些药物、激素等各种半抗原半抗原物质。物质。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/510二、二、酶标记免疫分析法及常用标记酶酶标记免疫分析法及常用标记酶1 1、免疫分析法分类、免疫分析法分类第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/5112 2、酶标记免疫分析法中使用的酶、酶标记免疫分析法中使用的酶（1 1）酶联免疫分析中使用的酶应）酶联免疫分析中使用的酶应

12、符合下列条件符合下列条件：纯度高纯度高、催化反应的转化速率高、催化反应的转化速率高、专一性强专一性强；具有具有足够的足够的偶联用偶联用标记基团标记基团，与抗原、抗体蛋白分子，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性；偶联后仍保持较高的催化活性；使用使用稳定性稳定性和保存稳定性和保存稳定性好好；测定测定酶活性的酶活性的方法简便方法简便、灵敏灵敏、快速快速；待测待测体液中不存在体液中不存在与标记酶相同的酶；与标记酶相同的酶；第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/512待测溶液中待测溶液中应该应该无底物无底物、反应抑制剂反应抑制剂和其他与酶发生和其他与酶发生反应的反应的干

13、扰物质干扰物质；酶的来源、纯化和供应酶的来源、纯化和供应较方便较方便，价格，价格较低廉较低廉；均相酶免疫测定均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗法中使用的酶，还要求当抗体与半抗原原- -酶酶结合物结合结合物结合后，酶活性表现出后，酶活性表现出抑制或激活抑制或激活。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/513（2 2）酶的评价指标酶的评价指标 通常通常用用RZRZ和和酶的比活酶的比活力评价力评价标记标记酶的质量。酶的质量。 RZRZ表示酶蛋白中表示酶蛋白中活性部分活性部分与与非活性部分非活性部分最大吸光度的最大吸光度的比值。比值。 酶的比活酶的比活力力指在特定条件

14、下，每指在特定条件下，每1mg1mg酶酶或或每每1ml1ml酶液所酶液所具有的酶活性单位数具有的酶活性单位数。（3 3）酶联免疫分析中的常用酶酶联免疫分析中的常用酶 下表下表列出了酶联免疫列出了酶联免疫分析中的常用酶。分析中的常用酶。其中其中ECEC编号编号是是根据国际酶学委员会根据国际酶学委员会的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/514酶酶来源来源EC编号编号辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根辣根1.11.1.7酸性磷酸酶酸性磷酸酶动植物动植物3.1.3.2碱性磷酸酶碱性磷酸酶牛肠牛

15、肠3.1.3.1-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶大肠杆菌大肠杆菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶曲霉菌曲霉菌1.1.3.4脲酶脲酶Jack豆豆3.5.1.5青霉素酶青霉素酶3.5.2.6过氧化氢酶过氧化氢酶肝肝1.11.1.6葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶根霉菌根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶碳酸苷酶牛红细胞牛红细胞4.2.1.1乙酰胆碱酶乙酰胆碱酶3.1.1.7葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶肠系膜明串细菌肠系膜明串细菌1.1.1.49溶菌酶溶菌酶鸡卵白鸡卵白3.2.1.17苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶猪心线粒体猪心线粒体1.1.1.49无机焦磷酸酶无机焦磷酸酶大肠杆菌大肠杆菌3.6.1.1荧光素

16、酶荧光素酶发光生物发光生物1.3.12.7丙酮酸激酶丙酮酸激酶哺乳动物组织哺乳动物组织2.7.1.40酶联免疫分析常用酶酶联免疫分析常用酶第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/515辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidasehorseradish peroxidase，HRPHRP）是是一种一种提取提取自自辣根中辣根中，相对，相对分子质量为分子质量为44kDa44kDa的的糖蛋糖蛋白白。 其酶学活性部分包括其酶学活性部分包括脱辅基蛋白脱辅基蛋白和和血红素基团血红素基团，辅基，辅基亚铁血红素在亚铁血红素在403nm403nm波长呈现最大光吸收

17、值。波长呈现最大光吸收值。 HRPHRP的纯度以的纯度以RZRZ值即值即A A403nm403nm/A/A275nm275nm的值来衡量，高纯度的值来衡量，高纯度HRPHRP制剂的制剂的RZ3.0RZ3.0。 通常以能在通常以能在2020、pHpH为为6.06.0、20s20s的时间内催化底物的时间内催化底物邻邻苯三酚苯三酚产生产生1mg1mg红桔酚红桔酚（purpurogallinpurpurogallin）作为）作为HRPHRP酶酶的的1 1个活性单位。个活性单位。 用于标记的用于标记的HRPHRP比活性应比活性应大于大于250U/mg250U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫

18、分析概述2021/8/516碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatasealkaline phosphatase，APAP）几乎存在）几乎存在于动物和人体的所有组织中，尤其在肝脏、胎盘、白于动物和人体的所有组织中，尤其在肝脏、胎盘、白细胞、肾小管中含量高。细胞、肾小管中含量高。 APAP是一种是一种磷酸酯磷酸酯的水解酶，它能够催化磷酸单酯、的水解酶，它能够催化磷酸单酯、磷磷酸核苷酸核苷及及6-6-磷酸糖类磷酸糖类等的水解，在释放磷酸盐的同时等的水解，在释放磷酸盐的同时产生有色的或荧光的产物。产生有色的或荧光的产物。 碱性磷酸酶的分子质量为碱性磷酸酶的分子质量为8080100k

19、Da100kDa，最适，最适pHpH为为8.08.010.010.0，随酶源和底物的不同而变化。，随酶源和底物的不同而变化。 APAP活性的测定以活性的测定以对硝基磷酸苯酯对硝基磷酸苯酯（PNPPNP）作为底物。）作为底物。 用作标记的用作标记的APAP比活比活力力应应大于大于1000U/mg1000U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/517葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（glucose oxidaseglucose oxidase，GODGOD）即即-D-D-葡葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生。 它催化它催化O O2

20、2和和-D-D-葡萄糖的反应形成葡萄糖的反应形成H H2 2O O2 2和和D-D-葡萄糖酸葡萄糖酸-内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。 其反应最适其反应最适pHpH范围为范围为4.04.07.07.0，pH5.5pH5.5时，反应速率时，反应速率最大。葡萄糖氧化酶对最大。葡萄糖氧化酶对-D-D-葡萄糖的葡萄糖的-异头碳有异头碳有高高度专一性度专一性。 葡萄糖氧化酶的比活葡萄糖氧化酶的比活力力至少为至少为20U/mg20U/mg。 葡萄糖氧化酶在葡萄糖氧化酶在44下可稳定存在下可稳定存在6 61212个月。个月。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/

21、8/518-D-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（-D-galactosidase-D-galactosidase，GalGal）即即乳乳糖酶（糖酶（-lactase-lactase），广泛存在于植物、动物器官、），广泛存在于植物、动物器官、细菌、酵母和真菌中。细菌、酵母和真菌中。 当当GalGal催化水解催化水解-D-D-半乳糖苷时，若得到的半乳糖残半乳糖苷时，若得到的半乳糖残基转移到水分子受体，称为基转移到水分子受体，称为水解水解；若受体是糖或醇时；若受体是糖或醇时，称为，称为转半乳糖苷转半乳糖苷。 GalGal催化催化-D-D-半乳糖苷水解反应的最适半乳糖苷水解反应的最适pHpH为为7.57.5

22、，转，转化效率很高，且比化效率很高，且比HRPHRP易于标记，背景值低，稳定性易于标记，背景值低，稳定性好。好。 GalGal比活比活力力应不少于应不少于30U/mg30U/mg，55能保存能保存1 12 2年。年。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2021/8/519第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法一、一、光度酶联免疫分析光度酶联免疫分析1 1、酶联免疫吸附分析（、酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent enzyme-linked immunosorbent assayassay，ELISAELISA）原理）原理使抗原或抗体使抗

23、原或抗体结合结合到某种到某种固相载体表面固相载体表面；抗原或抗体与某种酶联结成抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原酶标抗原或或抗体抗体； 在测定时，使在测定时，使受检标本受检标本和和酶标抗原酶标抗原或抗体按不同的步或抗体按不同的步骤骤与固相抗原与固相抗原或固相抗体起或固相抗体起反应反应； 用用洗涤洗涤的方法使固相载体上形成的的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物抗原抗体复合物与与其他物质分开，结合在固相载体上的其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与酶量与标本中标本中受受检物质的量成检物质的量成一定的一定的比例比例； 加入酶反应加入酶反应底物底物，底物被酶催化为，底物被酶催化为有色产物有色产物，产物

24、量，产物量与与标本中标本中受检物受检物的的量相关量相关，用分光光度法进行定量。，用分光光度法进行定量。2021/8/520* *A Ag g是是酶标志抗原酶标志抗原，A Ag g是是未标志抗原未标志抗原，A Ab b是特异性抗体是特异性抗体，(F)(F)表示游离型的表示游离型的* *A Ag g，(B)(B)表示结合型的表示结合型的* *A Ag g- -A Ab b。*( )( )gbgbggbAAAAFBAAA第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/5212 2、ELISAELISA的固相载体的固相载体 良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好吸附

25、性能好，空白值低空白值低，孔底，孔底透明度高透明度高，各板之间、同一板各孔之间，各板之间、同一板各孔之间性能相近性能相近。 最常用的是最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯。 聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。值也略高。 ELISAELISA载体的形式有载体的形式有小试管小试管、小珠小珠和和微量反应板微量反应板。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/5223 3、固相载体的包被与封闭、固相载体的包被与封闭（1 1）包被包被（coatingcoating）指将）指将抗原抗原或抗体或抗体连接连接到到固相载体固相载体上

26、的过程。上的过程。 以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶于于pH 9.6pH 9.6的的碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液（或（或pH 7.2pH 7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液，pH 7pH 78 8的的Tris-HClTris-HCl缓冲液）中，缓冲液）中，加满反应孔加满反应孔，置，置44过夜过夜，洗涤即可。，洗涤即可。 包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。 一般蛋白质的包被浓度为一般蛋白质的包被浓度为

27、0.10.12020g/mlg/ml。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/523（2 2）封闭封闭（blockingblocking）指继包被之后用）指继包被之后用高浓度高浓度的的无关无关蛋白质蛋白质溶液溶液再包被再包被的过程。的过程。 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。 所有的所有的ELISAELISA固相载体均需封闭固相载体均需封闭。 常用封闭剂有常用封闭剂有0.05%0.05%0.5% 0.5% BSABSA；10%10

28、%小牛血清小牛血清或或1%1%明明胶胶；脱脂奶粉脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用（，比较价廉，可高浓度使用（5%5%）。）。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/5244 4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液、稀释液、洗涤液和酶反应终止液（1 1）稀释液稀释液用于稀释酶标抗体及标本。用于稀释酶标抗体及标本。 常用常用中性中性PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓冲液缓冲液，其中含有，其中含有无关高浓无关高浓度蛋白度蛋白（如（如1010动物血清、动物血清、1 1BSABSA（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）、1 1明胶等）和明胶等）和非离子型表面活性剂非离子型表面

29、活性剂（如（如0.050.05Tween 20Tween 20或或TritonX-100TritonX-100等）。等）。（2 2）洗涤液洗涤液一般与稀释液相同，常用一般与稀释液相同，常用PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓缓冲液。冲液。 四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表7-7-2 2。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/525编编号号吐温吐温20/%组成组成稀稀释释液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH

30、7.4，含，含EDTA 10mmol/L4PBS 0.05mol/L，pH 6.9，含，含EDTA 10mmol/L洗洗涤涤液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl缓冲液缓冲液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L表表7-2 常用的抗体稀释液和洗涤液常用的抗体稀释液和洗涤液第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/526（3 3）酶反应终止液）酶反应终止液 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）反应终止液为）反应终止液为2mol/L2mol/L4mol/L 4mol/L

31、H H2 2SOSO4 4（HRPHRP在酸性条件下丧失酶活性）。在酸性条件下丧失酶活性）。 很多很多ELISAELISA试剂采用试剂采用碱性磷酸酶碱性磷酸酶（APAP）作为标记酶）作为标记酶，用用3mol/L NaOH3mol/L NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一终止酶反应后，黄色可稳定一段段时间。时间。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/5275 5、ELISAELISA法常用酶的底物系统法常用酶的底物系统 ELISAELISA法法对底物的要求对底物的要求： 价廉易得价廉易得、安全安全； 显色性显色性和和稳定性稳定性好好； 底物底物本身最好本身最好为为无色无色

32、物质物质； 终止终止酶催化反应后酶催化反应后，底物底物不应再不应再继续地继续地自发性变性自发性变性； 其最终其最终产物可溶产物可溶、易于测定易于测定及及光吸收值高光吸收值高。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/528（1 1）辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶的底物系统的底物系统 常见底物有常见底物有邻苯二胺邻苯二胺（OPDOPD，产物橙红色，测定波长，产物橙红色，测定波长492nm492nm）、）、5-5-氨基水杨氨基水杨酸酸 （ 5 - A S5 - A S ， 产 物 橙 色 ， 测 定 波 长， 产 物 橙 色 ， 测 定 波 长 5 5 0 n m5 5 0 n

33、 m ） 、） 、3,3,5,5-3,3,5,5-四甲基联苯胺四甲基联苯胺（TMBTMB，产物红色，测定，产物红色，测定波长波长450nm450nm）、）、2,2-2,2-连氮连氮- -二二（3-3-乙基苯并噻唑啉乙基苯并噻唑啉- -6-6-磺酸盐磺酸盐）（）（ABTSABTS）等。）等。 ABTSABTS的的反应曲线不好反应曲线不好。 OPDOPD溶液具有溶液具有光敏性光敏性，相对来说不稳定，且具有诱变，相对来说不稳定，且具有诱变特性特性。 TMBTMB的的背景值低背景值低，溶液，溶液稳定稳定，没有诱变没有诱变特性。特性。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/529

34、（2 2）碱性磷酸酶碱性磷酸酶的底物系统的底物系统 常用的底物为常用的底物为对硝基磷对硝基磷酸苯酯酸苯酯（PNPPNP），水解的产物为黄色的对硝基苯酚，），水解的产物为黄色的对硝基苯酚，可在可在405nm405nm处检测其吸光度的变化，该底物的转化效处检测其吸光度的变化，该底物的转化效率高，线性关系好率高，线性关系好。 用用酚酞磷酸酯酚酞磷酸酯为底物，水解生成的酚酞在碱性条件下为底物，水解生成的酚酞在碱性条件下呈红色，可在呈红色，可在530nm530nm处光度法测定处光度法测定。 此外还可以此外还可以百里酚酞单磷酸酯百里酚酞单磷酸酯等等为为底物。底物。 第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫

35、吸附分析法2021/8/530（3 3）-D-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶的底物系统的底物系统 常见底物有常见底物有邻硝基邻硝基苯苯-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（ONPGONPG），其水解的产物邻硝基苯），其水解的产物邻硝基苯酚在酚在405nm405nm处具有最大吸光度值处具有最大吸光度值。 其他的底物有其他的底物有对硝基苯对硝基苯-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（PNPGPNPG）、）、苯苯基基-D-D-半乳糖苷半乳糖苷、氯酚红氯酚红-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（CPRGCPRG）、9-9-羟基羟基-3-3-异吩噁唑酮异吩噁唑酮-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（RGRG）等。）等。（4 4）青霉素酶青霉素酶（P

36、NCPNC）的底物系统）的底物系统 常用底物有常用底物有溴麝香溴麝香草酚蓝草酚蓝（BTBBTB）、）、青霉酮酸还原淀粉青霉酮酸还原淀粉- -碘复合物碘复合物（SICSIC）、）、溴甲酚紫溴甲酚紫（BCPBCP）和）和溴麝香草酚蓝溴麝香草酚蓝（2 21 1）等。）等。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/531二、二、ELISAELISA酶联方法和试验方法酶联方法和试验方法1 1、ELISAELISA酶联方法酶联方法 ELISAELISA酶联方法主要有两种，即酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法戊二醛交联法和和过碘过碘酸盐氧化法酸盐氧化法。 （1 1）戊二醛交联法戊二醛交

37、联法 戊二醛是一种双功能团试剂，戊二醛是一种双功能团试剂，它可以它可以联结具有氨基的酶和蛋白质联结具有氨基的酶和蛋白质。 戊二醛交联法有戊二醛交联法有一步法一步法、两步法两步法两种。两种。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/532NH2+ HCCHOONH2+CCNHHNCCNHHNCCNHHN+图图7-2 戊二醛一步法反应原理戊二醛一步法反应原理一步法一步法 将戊二醛将戊二醛直接直接加入加入酶与抗体的混合物酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记中，反应后即得酶标记抗体。抗体。 该法操作该法操作简便简便、有效有效，重复性好重复性好。 缺点是交联反应是缺点是交联反应是随

38、机随机的，酶与酶、抗体与抗的，酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。体之间有可能交联。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/533HCCHOONH2+CCNOHHCCNHHNNH2图图7-3 戊二醛二步法反应原理戊二醛二步法反应原理两步法两步法 先将先将酶与戊二醛酶与戊二醛作用作用，透析透析除去多余的除去多余的戊二醛后，再与戊二醛后，再与抗体抗体作作用而形成酶标抗体；用而形成酶标抗体；或或先将抗体与戊二醛作用先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。，再与酶联结。 两步法的产物中绝大部两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，的比例结合的，有助于

39、有助于本底的改善本底的改善。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/534（2 2）过碘酸盐氧化法）过碘酸盐氧化法 本法只适用于本法只适用于含糖量较高含糖量较高的酶。的酶。 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）的标记常用此法。）的标记常用此法。 反应时，反应时，过碘酸钠过碘酸钠将将HRPHRP分子表面的多糖氧化为活泼分子表面的多糖氧化为活泼的的醛基醛基，可与蛋白质上的氨基形成，可与蛋白质上的氨基形成SchiffSchiff氏碱氏碱而结合。而结合。 图图7-4 7-4 过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/53

40、52 2、ELISAELISA试验方法试验方法 ELISAELISA法中有三个必要试剂：法中有三个必要试剂：固相抗原固相抗原或抗体；或抗体；酶标记抗原酶标记抗原或抗体；或抗体；酶反应底物酶反应底物。 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。 如如双抗体夹心法双抗体夹心法、间接法间接法、竞争法竞争法、异种动物抗体双异种动物抗体双夹心法夹心法、抗酶抗体法抗酶抗体法、竞争性抑制法竞争性抑制法、双夹心法双夹心法和和抗抗原直接包被法原直接包被法等方法。等方法。第二节第二节 酶联免疫吸附分析

41、法酶联免疫吸附分析法2021/8/536（1 1）双抗体夹心法双抗体夹心法 双抗体夹心法双抗体夹心法（double antibody sandwichdouble antibody sandwich，DAS-DAS-ELISAELISA）由）由ClarkClark和和AdamsAdams于于19771977年建立，是最经典的年建立，是最经典的ELISAELISA检测法检测法。 该法的该法的灵敏度高灵敏度高，特异性强特异性强，但提纯免疫球蛋白和制，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求备酶标记物要求技术性强技术性强，成本较高成本较高。 该法该法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和只适用于二价或

42、二价以上较大分子抗原的检出和定量分析定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。，而不能用于半抗原等小分子的测定。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/537图图7-5 双抗体夹心法双抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/538（2 2）间接法间接法 间接法间接法（indirect ELISAindirect ELISA）是最常用的）是最常用的ELISAELISA检测方检测方法，其原理是利用法，其原理是利用酶标记的抗体酶标记的抗体和已与和已与固相抗原固相抗原结合结合的受检的受检抗体抗体相结合。相结合。 该法只要该法只要更换不同的固相抗

43、原更换不同的固相抗原，就可以，就可以用一种酶标抗用一种酶标抗抗体检测抗体检测各种与抗原相应的抗体。各种与抗原相应的抗体。 该方法不必为每个待测抗体（或抗原）制备特异性的该方法不必为每个待测抗体（或抗原）制备特异性的酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地简化简化了实验。了实验。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/539图图7-6 间接法间接法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/540（3 3）竞争法竞争法 竞争法（竞争法（competing ELISAcompeting ELISA）是利用）是利用待测抗原待测抗原和

44、和酶标酶标抗原抗原与与特异性抗体特异性抗体竞争结合，竞争结合，或或待测抗体和酶标抗体待测抗体和酶标抗体与特异性抗原竞争结合而进行测定的一种方法（图与特异性抗原竞争结合而进行测定的一种方法（图7-7-7 7）。）。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/541图图7-7 竞争法竞争法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/542（4 4）异种动物抗体双夹心法异种动物抗体双夹心法 异种动物抗体双夹心法异种动物抗体双夹心法（图（图7-87-8），又称），又称间接双抗体间接双抗体夹心法夹心法（indirect DAS-ELISAindirect DAS-

45、ELISA）或）或三抗体夹心法三抗体夹心法（triple antibodies sandwichtriple antibodies sandwich，TAS-ELISATAS-ELISA）。）。 此法可用此法可用通用的酶标记抗体检验多种病毒通用的酶标记抗体检验多种病毒，它不仅免，它不仅免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/543图图7-8 异种动物抗体夹心法异种动物抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/544（5 5）抗酶抗体法抗酶抗体法 抗酶抗体法抗酶抗

46、体法（图（图7-97-9）是）是利用免疫学反应利用免疫学反应而不是用化而不是用化学交联反应来学交联反应来制备酶结合物制备酶结合物，常用，常用HRPHRP为标记酶为标记酶作为作为抗原抗原免疫动物制备抗免疫动物制备抗HRPHRP抗体抗体。 可用一种动物（如可用一种动物（如兔兔）制备）制备特异性抗体特异性抗体（第一抗体）（第一抗体）和和抗酶抗体抗酶抗体（第三抗体），再用另一种动物（如（第三抗体），再用另一种动物（如羊羊）制备制备抗第一种动物抗第一种动物（兔）（兔）IgGIgG的抗体的抗体（第二抗体）。（第二抗体）。 让这种抗让这种抗IgGIgG的的第二抗体第二抗体把把第一抗体第一抗体（兔（兔IgGI

47、gG）和）和抗酶抗酶抗体抗体（也为兔（也为兔IgGIgG）通过免疫学反应连接起来。）通过免疫学反应连接起来。 最后让最后让酶与抗酶抗体结合酶与抗酶抗体结合，通过对底物的作用而揭示，通过对底物的作用而揭示在固相载体上待测抗原的存在。在固相载体上待测抗原的存在。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/545 优点优点:HRP:HRP通过免疫学反应与抗体结合通过免疫学反应与抗体结合，避免了用化学，避免了用化学方法交联时抗体活性的改变，也避免了方法交联时抗体活性的改变，也避免了HRPHRP与其他蛋与其他蛋白质分子结合，白质分子结合，防止防止标记抗体和游离的未标记抗体之标记抗体和

48、游离的未标记抗体之间的间的竞争竞争，提高了标记抗体的质量提高了标记抗体的质量。 在纯化化学交联反应制备的酶结合物的过程中，除去在纯化化学交联反应制备的酶结合物的过程中，除去未标记抗体比较困难，而且该法未标记抗体比较困难，而且该法仅在制备抗酶抗体时仅在制备抗酶抗体时用少量纯用少量纯HRPHRP作抗原作抗原，所以用较粗制的，所以用较粗制的HRPHRP与抗酶抗体与抗酶抗体形成免疫复合物，并不影响其质量，这大大形成免疫复合物，并不影响其质量，这大大节约节约了价了价格较昂贵的精制格较昂贵的精制HRPHRP。 因为制备抗酶抗体必须在动物中进行，故抗酶抗体法因为制备抗酶抗体必须在动物中进行，故抗酶抗体法多多

49、适用于检测动物中的抗体适用于检测动物中的抗体。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/546图图7-9 抗酶抗体法抗酶抗体法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/547三、三、ELISA反应条件的反应条件的选择选择1 1、酶标抗体浓度的选择、酶标抗体浓度的选择 先用先用200200L L IgGIgG（100 100 mg/mlmg/ml）包被包被小孔，小孔，再再将将酶标记抗体球蛋白酶标记抗体球蛋白系系列稀释并加入小孔中，列稀释并加入小孔中，洗涤洗涤后，加后，加底物底物反应反应，终止终止后后测定测定吸光度。吸光度。 选择选择吸光度为吸光度为1

50、1的稀释的稀释度度作为酶标抗体最适浓作为酶标抗体最适浓度。度。图图7-10 酶标抗体浓度的选择酶标抗体浓度的选择第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/5482 2、包被浓度的选择、包被浓度的选择 当包被抗原的当包被抗原的浓度较浓度较低时低时，包被量，包被量随随抗原抗原浓度的增加浓度的增加而而增大增大；当包被抗原当包被抗原达到一定达到一定浓度后浓度后，包被量为定包被量为定值值，不再随抗原浓度，不再随抗原浓度的增加而增大的增加而增大。 此浓度称为此浓度称为抗原的饱抗原的饱和包被浓度和包被浓度。图图7-11 抗原包被量和抗原包被量和ELISA反应的关系反应的关系 第二节第二

51、节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/549 表表7-3 SM-EDA-GA7-3 SM-EDA-GA包被法中链霉素包被质量浓度对包被法中链霉素包被质量浓度对ELISAELISA实验误差的影响实验误差的影响包被质量浓度（包被质量浓度（mg/mlmg/ml）ELISAELISA测定结果（测定结果（A A492492SDSD）（n n=4=4）4 41.0981.0980.06280.06281 1* *1.0111.0110.03020.03020.50.50.9690.9690.08760.08760.250.250.7920.7920.10230.1023第二节第二节 酶联免

52、疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/5503 3、酶、酶- -底物反应时间的选择底物反应时间的选择 抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在3737反应反应2 23h3h达到高峰。达到高峰。 时间太短，敏感性下降，时间太长，吸附的抗原或复时间太短，敏感性下降，时间太长，吸附的抗原或复合物（在这个温度下）可能脱落。合物（在这个温度下）可能脱落。 酶酶- -底物反应时间一般采用底物反应时间一般采用15min15min、30min30min或或45min45min，也，也可以标准阳性血清为准可以标准阳性血清为准，随时测定其，随时测定其ODOD值，当值，当达到规

53、达到规定的定的ODOD值时，即终止反应值时，即终止反应。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/551四、四、ELISAELISA的定量计算与灵敏度的定量计算与灵敏度1 1、ELISAELISA的定量计算的定量计算 一般采用分光光度计测定结合物中的酶量和抗体蛋白一般采用分光光度计测定结合物中的酶量和抗体蛋白（IgGIgG）量，酶量和）量，酶量和IgGIgG计算方法如下。计算方法如下。 其中，其中，0.40.4表示酶的表示酶的A A403nm403nm值为值为1 1时，酶量为时，酶量为0.4mg/ml0.4mg/ml；0.420.42表示酶的表示酶的A A403nm403

54、nm值为值为1 1时，其相应时，其相应A A280nm280nm值为值为0.420.42；0.620.62表示在表示在A A280nm280nm值为值为1 1时，时，IgGIgG量为量为0.62mg/ml0.62mg/ml；0.940.94表示酶、戊二醛结合后，表示酶、戊二醛结合后，A A280nm280nm增加约增加约6 6。403/0.4nmmg mLA酶量（）62. 094. 0)42. 0(/IgG403280nmnmAAmLmg）量（第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/552 酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方法酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方法：

55、以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算方法方法： 酶量酶量为为1mg/ml1mg/ml，摩尔比值摩尔比值为为1.51.52.02.0，酶结合率酶结合率在在30%30%以上以上时，可获得较好的时，可获得较好的ELISAELISA分析结果。分析结果。）结合物溶液量（）每毫升溶液中的酶量（）结合物中酶量（mLmLmgmg/%100%）标志时加入的酶量（）结合物中酶量（酶结合率mgmgHRPHRP/HRPHRP/160000IgGIgG/IgGIgG/40000mg mLmg mLmg mLmg mL（）分子量（）（摩尔比）（）分子量（）第二节第二

56、节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/5532 2、ELISAELISA的灵敏度与的灵敏度与ELISAELISA放大系统放大系统（1 1）ELISAELISA的灵敏度的灵敏度 ELISAELISA的检出限已经达到的检出限已经达到1010-8-81010-12-12g g，但对某些测定仍需更高的灵敏度。，但对某些测定仍需更高的灵敏度。 传统传统ELISAELISA中显色剂发色团的吸光度是限制中显色剂发色团的吸光度是限制ELISAELISA灵敏灵敏度的主要因素度的主要因素。 改用荧光标记改用荧光标记或其他化学发光物标记抗体替代酶标记或其他化学发光物标记抗体替代酶标记抗体可以提高灵敏

57、度。抗体可以提高灵敏度。 改变改变传统传统ELISAELISA的的操作程序操作程序也可以提高灵敏度，如也可以提高灵敏度，如SIMITSIMIT技术。技术。 采用放大系统采用放大系统是提高是提高ELISAELISA灵敏度的灵敏度的主要途径主要途径。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/554（2 2）ELISAELISA放大系统放大系统 生物素生物素- -亲和素放大系统亲和素放大系统可可增增加抗体（或抗原）的标记率。加抗体（或抗原）的标记率。 生物素与亲和素结合速率较快且结合物的稳定性高（生物素与亲和素结合速率较快且结合物的稳定性高（K K=10=101515），不会在

58、孵育和各种洗涤过程中脱落。），不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。 生物素对抗体和酶的标记率高（生物素对抗体和酶的标记率高（1010个生物素分子个生物素分子/ /抗抗体分子）体分子），且，且生物素分子易于活化，生物素分子易于活化，标记后标记后不影响抗不影响抗体和酶的活性。体和酶的活性。 每个亲和素分子能结合每个亲和素分子能结合4 4个生物素个生物素，因而可因而可偶联更多偶联更多的联结生物素的酶分子，从而提高的联结生物素的酶分子，从而提高ELISAELISA的敏感性。的敏感性。 生物素生物素- -亲和素标记体系有灵活多变的运用方式，可亲和素标记体系有灵活多变的运用方式，可以适应不同的分析设计。以适应

59、不同的分析设计。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/555微粒放大微粒放大。用适当的微粒代替酶。用适当的微粒代替酶- -抗体结合物也可以抗体结合物也可以获得放大效果。获得放大效果。 每个微粒表面可以同时结合大量记酶和抗体分子。在每个微粒表面可以同时结合大量记酶和抗体分子。在包含微粒放大的夹心包含微粒放大的夹心ELISAELISA法中，法中，微粒通过结合于其微粒通过结合于其上的第二抗体结合于抗原上的第二抗体结合于抗原。微粒上又结合着标记酶，。微粒上又结合着标记酶，其数量远比第二抗体能结合的标记酶多，因此得以放其数量远比第二抗体能结合的标记酶多，因此得以放大。大。 例如

60、，微颗粒放大系统用例如，微颗粒放大系统用微颗粒硅胶微颗粒硅胶（直径（直径约约40nm40nm）作为中间体连接酶和抗体，避免酶和抗体直接连接作为中间体连接酶和抗体，避免酶和抗体直接连接。酶微颗粒硅胶可连接上千个酶分子，可使体系增敏，酶微颗粒硅胶可连接上千个酶分子，可使体系增敏，已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2021/8/556五、五、ELISA法的应用法的应用 酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性，几乎所有的酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性，几乎所有的可溶性抗原可溶性抗原- -抗体系统均可用以