纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响ppt课件

1、LOGO纳米多孔纳米多孔Al2O3薄膜对成骨细胞的影薄膜对成骨细胞的影响响Osteogenic differentiation of marrow stromal cells cultured on nanoporous alumina surfacesPublished online 6 November 2019 in Wiley InterScience (interscience.wiley).文献出处文献出处简介资料和方法实验结果结论简介简介u用于骨科整形的生物资料面临的一个挑战就是设计资料外表可以满足以下两个条件：u允许依赖锚定的成骨细胞的粘附；u提高成骨细胞的分化才干，从而使成熟

2、的成骨细胞群体可以在适当的生物资料外表快速地构成一个界面层。 影响骨植入界面的重要相关参数有外表成分，外表能，外表粗糙度和外表形貌。研讨者曾经证明将资料外表控制在微米或纳米范围内可以改动各种类型细胞的分化程度。骨有一系列分等级的构造包括宏观构造，微观构造和纳米构造。因此，资料外表有等级的形貌，类似于骨的分级构造，将诱导不同的生物反响。本文论述纳米级的形貌对成骨细胞功能的影响。经过检测得知碱性磷酸酶ALP的活性和基质产量增多。Klawitter 和Hulbert 1 运用氧化陶瓷，证明了孔径为100m的多孔外表对于适宜的骨内生是必需的。Bobyn 等 2运用金属植入管，当孔径在50-400m之间

3、表现出良好的骨内生性。研讨显示3在高密度的氧化金属层上的更小的孔径能允许骨的长入。例如，在外科手术2-3周后，CaP涂层的多孔植入管和人骨展现出了一样的骨内生性。在一项研讨中，随着纳米氧化铝颗粒从167nm降到24nm，成骨细胞的粘附添加50%。与常见孔径微米级的氧化铝相比，细胞的增殖才干，碱性磷酸酶的活性，细胞外基质的产量都有明显的添加。1Klawitter JJ, Hulbert SF. Application of porous ceramics for the attachment of load bearing internal orthopedic applications.J B

4、iomed Mater Symp 1972;2:161229.2 Bobyn JD, Pilliar RM, Cameron HU, Weatherly GC. The optimum pore size for the fixation of porous-surfaced metal implants by the ingrowth of bone. Clin Orthop Relat Res 1980;150:263270.3 Lee TM, Wang BC, Yang YC, Chang E. Comparison of plasma-sprayed hydroxyapatite co

5、atings and hydroxyapatite/ tricalcium phosphate composite coatings: In vivo study. J Biomed Mater Res 2019;55:360367.实验资料 作为一个生物可相容的陶瓷，已被广泛地运用于整形外科和牙移植手术。氧化物使铝外表在生物环境中具有惰性，因此它是移植工程运用中的可供选择的一种资料。经过阳极氧化处置控制纳米多孔氧化铝的构造，并维持纳米相资料或微米构造陶瓷不具有的机械特性。 纳米多孔氧化铝纳米多孔氧化铝 (Al2O3) 骨髓基质细胞在培育过程中可向成骨细胞方向分化，随着培育时间的延伸，特别是在

6、某些生长因子的影响下，90 %以上的细胞可表现出成骨细胞的特征，由于骨髓基质细胞取材方便、成骨才干较明确，同时来源广泛，因此可以用来评价它们与纳米构造外表的相互作用。 骨髓基质细胞骨髓基质细胞 MSCs 纳米多孔纳米多孔Al2O3薄膜的制备薄膜的制备高温退火除油电化学抛光第一步阳极氧化第二步阳极氧化清洗马弗炉，马弗炉，500，4h丙酮，丙酮，3min，室温室温磷酸和硫酸的混合液磷酸和硫酸的混合液 体积比为体积比为3:2 4%的铬酸和的铬酸和8%的磷酸混合液的磷酸混合液 99.99%的铝片2cm2cm0.5mm草酸，草酸，冰浴，冰浴，60，30min图一图一 电化学抛光安装电化学抛光安装10 1

7、5min磷酸和硫磷酸和硫酸混合液酸混合液8090图二图二 铝阳极氧化实验安装铝阳极氧化实验安装 (60 300min)草酸溶液草酸溶液(0.20.5mol/L)冰浴冰浴30 50V图三图三 纳米多孔氧化铝的扫描电镜图孔径为纳米多孔氧化铝的扫描电镜图孔径为79nm 细胞培育的预备细胞培育的预备Jackson实验室的C57 BJ 小鼠 处死，取下胫骨和股骨切除两端干骺端，显露骨髓腔10mL注射器内吸入改良的MEM培育液冲洗骨髓腔内容物 70m的尼龙过滤器 纳米多孔氧化铝薄膜放在六孔细胞培育板里加上盖子在紫外光下预消毒24小时 薄膜浸在70%的乙醇中消毒30分钟 将密度为15-25106/孔的骨髓基

8、质细胞和消毒过的纳米多孔薄膜一同放在六孔细胞培育板里 无定形状的氧化铝薄膜作为对照实验无定形状的氧化铝薄膜作为对照实验用血细胞计数器计算细胞数量 1细胞粘附和增殖细胞粘附和增殖2细胞生存才干细胞生存才干细胞功能细胞功能3456碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALPALP活性活性细胞外基质细胞外基质细胞形状细胞形状 骨髓基质细胞的密度为15106细胞/孔。在培育一天后，用胰蛋白酶处置，使细胞分别，察看细胞的粘附情况，培育四天和七天后察看其增殖才干，用血细胞计数器计数。细胞粘附和增殖细胞粘附和增殖 将粘附在氧化铝薄膜上的细胞用Calcein-AM着色检测细胞内的酯酶活性。 Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂

9、性很高，使其可透过细胞膜，在活细胞内酯酶的作用下，脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光 ，从而反映酯酶的活性。 细胞功能细胞功能 用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测其生存才干。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能翻开四唑环，使外源性MTT复原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并堆积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波优点测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。 细胞生存才干细胞生存才干碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALPALP活性活性( (细胞培育三周后细胞培育三周后检测检测) )在室温下，用混有2%的多聚甲醛的热的PBS溶液冲洗细胞三次细胞

10、固定好之后，向25mL去离子水中参与25mL碱性缓冲溶液制成碱性磷酸酶作用物溶液充分冲洗每个细胞培育板孔内参与1mL碱性磷酸酶作用物溶液在37条件下反响30分钟 移去0.5mL的溶液同时参与0.5mL NaOH终止反响 经过测定在410nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性 对硝基苯磷酸二钠+H2O碱性磷酸酶碱性磷酸酶对硝基苯酚+H3PO4细胞外基质细胞外基质(细胞培育三细胞培育三周后周后) 钙和磷是骨基质的主要成分，一旦细胞在资料外表开场分化，它们将堆积骨基质。从细胞培育板上取出样品风干，进展XPS分析检测钙和磷的含量。 XPSX射线光电子能谱的原理是用X射线去辐射样品，使原子或分子的内层

11、电子或价电子受激发射出来。被光子激发出来的电子称为光电子。可以丈量光电子的能量，以光电子的动能为横坐标，相对强度脉冲/s为纵坐标可做出光电子能谱图。根据能谱图中光电子谱线强度光电子峰的面积反响原子的含量或相对浓度 。细胞形状细胞形状在细胞培育三周后，用扫描电镜察看细胞的形状。 细胞固定，脱水 用PBS溶液冲洗2次 在含有3%的戊二醛，0.1M的甲胂酸钠，0.1M的蔗糖的定影剂中浸泡45分钟 用含有0.1M的甲胂酸钠和0.1M的蔗糖的缓冲液冲洗两次，每次5分钟 依次用35%，50%，70%，95%和100%的乙醇脱水细胞各10分钟用六甲基二硅烷浸泡细胞非常钟，使细胞枯燥。然后倒掉六甲基二硅烷，使

12、资料外表风干30分钟 将资料外表镀上一层10nm的金，扫描电镜电压设置为10-20kV 细胞粘附和增殖细胞粘附和增殖细胞生存才干细胞生存才干细胞功能细胞功能碱性磷酸酶活性碱性磷酸酶活性细胞外基质细胞外基质细胞形状细胞形状图四为用血细胞计数器测得的细胞在纳米多孔氧化铝和无定形状氧化铝外表的粘附培育1天后和增殖培育4天和7天后才干。结果显示，与无定形状氧化铝相比，纳米多孔氧化铝外表 (n=3，p0.01)的细胞的粘附和增殖才干更强。细胞粘附和增殖细胞粘附和增殖细胞生存才干细胞生存才干图五为 MTT分析在纳米多孔和无定形状氧化铝外表细胞培育1天和4天时中的甲瓒的吸光度 。结果显示细胞在纳米多孔氧化铝

13、 n=3，p0.01外表活细胞数更多，即具有更高的生存才干。细胞的功能细胞的功能图六为在资料外表的被Calcein-AM着色的活细胞图 (10)。细胞在无定形状氧化铝外表为球形的，而在纳米氧化铝外表为展开形状。碱性磷酸酶活性碱性磷酸酶活性图七为无定形状和纳米多孔氧化铝外表细胞培育2和3周后的碱性磷酸酶活性测定，经过测定在410nm处对硝基苯酚吸光度的变化速率来计算ALP 的活性，结果显示培育在纳米多孔氧化铝(n=3，p成骨细胞形状成骨细胞形状1周后周后图八 扫描电镜图像显示细胞在培育1周后粘附情况，与无定形状氧化铝相比，细胞在纳米多孔氧化铝外表聚集并呈现展开的形状，阐明细胞对纳米构造更顺应。AmorphousNanoporous成骨细胞形状成骨细胞形状2周后周后AmorphousNanoporous图九 细胞(培育2周后)在无定形状和纳米多孔氧化铝外表的扫描电镜图像。细胞在纳米多孔氧化铝外表进展延伸，进入分化阶段，而在无定形状氧化铝外表呈球形。 成骨细胞形状成骨细胞形状3周后周后NanoporousAmorphous图十 在培育3周后，纳米多孔氧化铝外表增殖的细胞经过储存基质构成网状构造，而在无定形状氧化铝外表无此网状构造。结论结论设计一种与成骨细胞有