蛋白质工程的崛起

1、19651965年，生物科学界发生了一件轰年，生物科学界发生了一件轰动全球的大事！动全球的大事！人工合成了结晶牛胰岛素，这是第人工合成了结晶牛胰岛素，这是第一个在实验室中用人工方法合成的一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质蛋白质, , 实现了世界上首次人工合成实现了世界上首次人工合成蛋白质的壮举。蛋白质的壮举。蛋白质工程蛋白质工程复习回顾复习回顾1、蛋白质的基本结构单位？元素组成？、蛋白质的基本结构单位？元素组成？2、蛋白质结构多样的原因？、蛋白质结构多样的原因？3、蛋白质有哪些功能？、蛋白质有哪些功能？4、蛋白质如何合成？涉及哪些细胞器？、蛋白质如何合成？涉及哪些细胞器？5、蛋白质的四级结构

2、、蛋白质的四级结构创新6、7蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 胰岛素的三级结构胰岛素的三级结构血红蛋白质的四级结构血红蛋白质的四级结构 血红蛋白分子血红蛋白分子就是由二个由就是由二个由141个氨基酸残个氨基酸残基组成的基组成的亚基亚基和二个由和二个由146个个氨基酸残基组氨基酸残基组成的成的亚基按特亚基按特定的接触和排定的接触和排列组成的一个列组成的一个球状蛋白质分球状蛋白质分子，每个亚基子，每个亚基中各有一个含中各有一个含亚铁离子的血亚铁离子的血红素辅基。红素辅基。 旁栏思考题旁栏思考题 你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？你知道人类蛋白质组

3、计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？我国科学家承担了什么任务？ 人类蛋白质组计划是继人类基因组计划人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，之后，生命科学乃至自然科学领域生命科学乃至自然科学领域一项重大一项重大的科学命题。的科学命题。20012001年，国际人类蛋白质组组年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：一项是两项重大国际合作行动：一项是由中国科学由中国科学家牵头家牵头执行的执行的“人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的另一项是以美国科学家牵头执行的“

4、人类血人类血浆蛋白质组计划浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。组计划的帷幕。 “人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划”是国际上是国际上第第一个人类组织器官的蛋白质组计划，一个人类组织器官的蛋白质组计划，由由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在设在北京北京，目前有，目前有16个国家和地区的个国家和地区的80多多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、并确认肝脏的蛋白质，为重大肝

5、病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。科学基础。 人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。白质工程的有力推动和理论支持。活动活动1、描述基因工程的操作步骤。、描述基因工程的操作步骤。目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。鉴定。2、讨论基因工程产生的蛋白质的特点。、讨论基因工程产生的蛋白质的特点。基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。基因工程在原则上只能生产自然

6、界已存在的蛋白质。基因工程的实质：基因工程的实质： 将一种生物的基因转移到将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以另一种生物体内，后者可以产生它本来不能产生的蛋白产生它本来不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。质，进而表现出新的性状。干扰素干扰素利用大肠杆菌及酵母菌生产干扰素利用大肠杆菌及酵母菌生产干扰素 生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中产生的，它的结构和性能不能完全满足中产生的，它的结构和性能不能完全满足人类生产生活的需要。人类生产生活的需要。例如：干扰素是动物体内的一种蛋白质是一种抗例如：干扰素是动物体内的一种蛋白质是一种抗病毒抗肿瘤的药物，

7、但在体外保存相当困难。于病毒抗肿瘤的药物，但在体外保存相当困难。于是我们要对现有的蛋白质进行改造，制造出目前是我们要对现有的蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们由开从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们由开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。 一、蛋白质工程崛起的缘由一、蛋白质工程崛起的缘由满足人类满足人类生产和生生产和生活的需要活的需要例如：例如：改造改造干扰素（半胱氨酸）干扰素（半胱氨酸）体外很难保存体外很难保存干扰素（丝氨酸）干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低玉米中赖氨酸含量比较低

8、天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶（352352位的苏氨酸）位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（104104位的天冬酰胺）位的天冬酰胺）天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶（异亮氨酸）（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍玉米中赖氨酸含量可提高数倍改造改造改造改造蛋白质工程就是为了生产出符合人蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。自然界不存在的蛋白质。1、基因工程的应用、基因工程的应用（1）基因工程的实质：将一种生物的）基因工程的实质：将一种生物的 转移到另

9、转移到另一种生物体内，使后者产生本不能产生的一种生物体内，使后者产生本不能产生的 ，进而表现出新的进而表现出新的 。（2）基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存）基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在的在的 。2、天然蛋白质的不足、天然蛋白质的不足 天然蛋白质是生物在长期天然蛋白质是生物在长期 过程中形成的，过程中形成的，它们的它们的 符合特定物种符合特定物种 的需要，却不的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。一定完全符合人类生产和生活的需要。3、蛋白质工程的目的、蛋白质工程的目的生产符合人类生产和生活的需要的生产符合人类生产和生活的需要的 。一、蛋白质工程崛起的缘由一、蛋白

10、质工程崛起的缘由基因基因蛋白质蛋白质性状性状蛋白质蛋白质进化进化结构和功能结构和功能生存生存蛋白质蛋白质二、蛋白质工程的基本原理二、蛋白质工程的基本原理1、目标：根据人们对、目标：根据人们对 功能的特定需功能的特定需 求，对蛋白质的求，对蛋白质的 进行分子设计。进行分子设计。2、原理：改造基因（基因、原理：改造基因（基因 或基因或基因 ） 。3、流程：、流程： 预期蛋白质功能预期蛋白质功能设计设计 推测应推测应有的有的 序列序列找到对应的找到对应的 序列。序列。蛋白质蛋白质结构结构修饰修饰合成合成预期的蛋白质预期的蛋白质 氨基酸氨基酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸二、蛋白质工程的基本原理二、蛋白质工程的

11、基本原理 对天然蛋白质进行改造，对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的进行操作，还是通过对基因的操作来实现？操作来实现？1、目标：、目标： 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。白质的结构进行分子设计。2.对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？答：毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋答：毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要

12、原因如下：白质改造，主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。作，难度要小得多。旁栏思考题旁栏思考题 由于基因决定蛋白质，要对蛋白质结构由于基因决定蛋白质，要对蛋白质结构

13、进行设计改造，必须进行设计改造，必须从基因入手从基因入手。 原理：改造基因原理：改造基因2、原理、原理二、蛋白质工程的基本原理二、蛋白质工程的基本原理、蛋白质工程的目标、蛋白质工程的目标 P263、蛋白质工程流程图：、蛋白质工程流程图：P272、 原理：基因改造原理：基因改造蛋白质蛋白质三维结构三维结构氨基酸序列氨基酸序列多肽链多肽链基因基因DNA预期预期功能功能DNA合成合成分子设计分子设计mRNA生物生物功能功能转录转录翻译翻译中心法则？中心法则？P27讨讨 论论折叠折叠4、蛋白质工程概念：、蛋白质工程概念：P27讨讨 论论答答：（：（1）每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查）每种氨基酸

14、都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出来就比较复杂，至少可以排列出16种种，可以根据学过，可以根据学过的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联密的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联密码子推出码子推出mRNA序列为序列为GCU（或（或C或或A或或G）UGGAAA（或（或G）AUGUUU（或（或C

15、），再根据碱基互），再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：补配对规律推出脱氧核苷酸序列：CGA（或（或G或或T或或C）ACCTTT（或（或C）TACAAA（或（或G）。）。（2）确定目的基因的碱基序列后，就可以根）确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过据人类的需要改造它，通过人工合成人工合成的方法的方法或从或从基因库基因库中获取。中获取。蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念v蛋白质工程是指以蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系功能的关系作为基础，通过作为基础，通过基因修饰或基因合成基因修饰或基因合成，对对现有现有蛋白质进行改造，

16、或制造一种蛋白质进行改造，或制造一种新新的蛋白质，的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。以满足人类的生产和生活的需求。 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第第二基因工程。二基因工程。蛋白质工程的实质是对编码蛋白质的基因进行改造蛋白质工程的实质是对编码蛋白质的基因进行改造。蛋白质工程操作程序的基本思路与基因蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？工程有什么不同？答：答：基因工程是遵循基因工程是遵循中心法则中心法则，从从DNAmRNA蛋白质蛋白质折叠产生功能折叠产生功能，基本上基本上是生产出自然界已有的蛋白质。是生产出自然界已有的蛋白质

17、。 蛋白质工程是按照以下思路进行的：蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能确定蛋白质的功能蛋白质应有的高级结构蛋白质应有的高级结构蛋蛋白质应具备的折叠状态白质应具备的折叠状态应有的氨基酸序列应有的氨基酸序列应应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。 注意：注意：蛋白质工程的原理应该是中心蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。法则的逆推。目的基因目的基因预期的蛋白质功能预期的蛋白质功能基因表达载体基因表达载体基因基因获取目的基因获取目的基因构建表达载体构建表达载体导入受体细胞导入受体细胞目的基因的检测与表达目的基因的检测与表达预期蛋白质

18、功能预期蛋白质功能设计蛋白质结构设计蛋白质结构推测氨基酸序列推测氨基酸序列推测核苷酸序列推测核苷酸序列合成合成DNA 表达出蛋白质表达出蛋白质定向改造生物的遗传特定向改造生物的遗传特性，获得人类所需的生性，获得人类所需的生物类型或生物产品物类型或生物产品定向改造或生产人类所定向改造或生产人类所需的蛋白质需的蛋白质生产自然界中已有的蛋生产自然界中已有的蛋白质白质蛋白质工程是在基因工程的基础上蛋白质工程是在基因工程的基础上,延伸出来的第延伸出来的第二代基因工程。因为对现有蛋白质的改造或制造二代基因工程。因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因的修饰或基因的合成。新的蛋白质，必须通过基因

19、的修饰或基因的合成。生产自然界没有的蛋生产自然界没有的蛋白质白质（一）蛋白质工程的内容（一）蛋白质工程的内容 蛋白质工程的内容主要有两方面：一是蛋白质工程的内容主要有两方面：一是根据需要设计具有特定氨基酸序列和空间结根据需要设计具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；二是确定蛋白质的化学组成及构的蛋白质；二是确定蛋白质的化学组成及空间结构与生物功能之间的关系。空间结构与生物功能之间的关系。 实施蛋白质工程的前提条件是了解蛋白质的结实施蛋白质工程的前提条件是了解蛋白质的结构和功能的关系。构和功能的关系。（1 1）从生物体中分离纯化目的蛋白；）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2 2）测定其氨基酸序列；

20、）测定其氨基酸序列；（3 3）借助核磁共振和）借助核磁共振和X X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构白质的二维重组和三维晶体结构; ;（4 4）设计各种处理条件，了解蛋）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；叠等对其活性与功能的影响；（5 5）设计编码该蛋白的基因改造）设计编码该蛋白的基因改造方案，如方案，如点突变点突变；（6 6）分离、纯化新蛋白，功能检）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。测后投入实际使用。（三）蛋白质改造工程举例（三）蛋白质改造工程举

21、例1水蛭素改造水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由多种变异体，由65或或66个氨基酸残基组成。水蛭素在个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体蛭素主要变异体HV2的设计方案，将的设计方案，将47位的位的Asn（天冬（天冬酰胺）变成酰胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第（赖氨酸），使其与分子内第4或第或第5位位Thr（苏氨酸

22、）间形成氢键来帮助水蛭素（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍，倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。倍。2生长激素改造生长激素改造生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需

23、使人其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基

24、酸侧链，如第侧链，如第18和第和第21位位His（组氨酸）和第（组氨酸）和第17位位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。为临床用药还有大量的工作要做。3胰岛素改造胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，酸残基结构所致。利

25、用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。胰岛素已通过临床实验。异想天开异想天开能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的细菌中，让细菌生产人类所需要的蛋因，导入合适的细菌中，让细菌生产人类所需要的蛋白质食品呢？白质食品呢？理论讲可以，但目前还没有真正成功的例子。一理论讲可以，但目前还没有真正成功的例子。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计自然界已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来而自然不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质出来而自然不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构和在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计和在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭新而又具有生命功能作用的蛋白质，而出一个崭新而又具有生命功