题目低温低光对铜绿微囊藻生长和光合活性响

1、题目低温低光对铜绿微囊藻生长和光合活性响单位铜山中学高一生物组作者魏海慧低温低光对铜绿微囊藻生长和光合活性的影响摘要运用正交实验设计方法研究了低温低光联合作用对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosaFACHB 905,以下简称905)生长与光合活性的影响。 采用植物效率分析仪(Water-PAM)测定 了 905 细胞的光合活性，并通过回复培养验证了其光合作用回复的能 力。实验结果表明：相 对于正常培养条件，低温低光对 M. aeruginosa 的生长均有不同程 度的抑制作用，在 9 °C 各处 理组中,mmginosd基本无法生长，因此可推测 905生长 的温度

2、阈值应高于9 °。在12 °各处 理组中，光强为影响 905 细胞生长的主要因子， 12 eC.2ME/m2s 能促进其初期的生长，据此推 测这一条件可能为微囊藻复苏的起始条件。 15 °C 各处理组中， 905 细胞在“微光 ”（2jjE/m2s） 处理组中电子传递速率及最大光量子 产量高于“低光” （10 卩助品）处理组，显示出相对于“低光”条件，铜绿微囊藻对“微光”的适应性更强。而回复培养的数据显示，9 °, 12 C处理组样品在 5d 内能迅速恢复 其生长与光合活性，并最终与 15 °C 处理组样品同样，稳定生长。 研究结果对解释铜绿微

3、 囊藻对湖泊底泥中越冬环境条件的耐受阈值及复苏的起始条件有重要 意义关键词：联合铜绿微囊藻阈值回复The effects of low temperature -low light on the growth and Photosyntheticactivity of Microcystis aeruginosaAbstractThe responses of growth and PS II activities in Microcystis aeruginosa (FACHB 905) has been studied under a condition of low light-temp

4、erature combination use orthogonal experiment method? The PS II activities were assayed with a Water-PAM, and also, the photosynthesis ofM. aeruginosa was verified via reculture under a normal condition ? The results showed that recruitment ofM. aeruginosa should not be triggered since it could hard

5、ly grow under the temperature of 9 C. Und°er 12 "C, the growth were greatly affected by the light intensity ? 12 C°& 2 pE/nrs combination was considered to be the threshold value to induce recruitment of Microcystis due to the physiological responses in growth and photosynthetic s

6、ystem. We also found FACHB 905 could persist longer under low light intensity (2 pE/m 2s) than a relative higher intensity (10( jE/m2s) under 15 C, s°ince the chlorophyll content, electron transfer rate and yield were relative higher in combination. Reculture of M. aeniginosa was conducted afte

7、r a-20d-study finished, samples under the temperatures of 9 C & 12 C°recove°red soon in growth characters and PSII activities during 5 days, and reached a rather stable growing status like other normal cultured samples finally? The present results should be important to determine the t

8、olerance threshold and even to reveal the probable mechanisms in overwintering and recruitment of M. aeruginosa from lake sediments.Key Words: combination; Microcystis aeruginosa ； threshold values; recruitment1.1. 1 蓝藻及蓝藻水华 21. 1. 1蓝藻概述 . 21.1.2 蓝藻水华及成因 21.2 铜绿微囊藻的形态特点 31.3低温低光对微囊藻生长的影响 . 31.3. 1 温

9、度的影响 31.3.2 光照的影响 41.4低温低光对微囊藻光合活性的影响 . 51.4 4.1 温度 51 光照 51.5 实验有关指标 . 67 5. 1叶绿色素a的测定 617 5.2 光合活性相关指标 62?材料与方法 718 1实验材料 78 1. 1 材料 71.5 1.2 主要药品试齐 I 72. 1.3 主要仪器 72.2 实验方法 7超净工作台的使用 723BG-11 培养基的配制 72. 2. 3 M. aeruginasa FACHB 905 的扩大培养 82. 3 藻的生物量 92. 3. 1叶绿素a测定 9藻的光合活性的测定 93. 研究结果 103. 1 M. ae

10、ruginasa FACHB 905 的生物量的变化 103.2低温低光条件下光合活性的变化 101.6 2. 1荧光量子产量 （Yield ） 109 2. 2 电子传递速率 （ETR） 1019 2. 3最大可变荧光 （Fv/Fm） 1020 回复实验 1221 讨论与分析 135. 1 低温低光对 M. aeruginasa FACHB 905 生长的影响 135. 2 低温低光对 M. aeruginasa FACHB 905 光合活性的影响 146?结论 15参考文献 16致谢 191 ? 引言近年来，随着水体富营养化的日益加剧，蓝藻水华频繁发生，其中尤以微囊藻水华最 受 关注。Re

11、ynolds et川通过对微囊藻生活史的研究发现其细胞存在越冬、复苏、暴发水华及沉降四个不同的阶段 （ReynoldsJ981）,孔繁翔等人的研究也证实了水华发生四阶段理论的存在仇繁翔，阎荣，韩小波，2003）。前研究表明，微囊藻的复苏可能受一系列理化、生 物、水文 和气象因素的影响，其中光照、温度、溶解氧及营养盐等被认为是影响藻类复苏的重要环境因子。吴晓东等人对比了太湖和巢湖的蓝藻越冬及复苏过程，发现水体营养盐浓度对这一生活史过程无显著影响（吴晓东，孔繁翔，张晓峰 , 2008） ,而最新研究结果 表明，沉积物的性状 对滇池微囊藻复苏影响较大（万能，汤俊，李林等 ,2009） o H 前，针

12、 对不同环境因子对微囊 藻复苏影响的模拟研究较多，山于微囊藻时空分布的不同，复苏所需温度不尽相同，多数学者认为复苏起始温度应在 10 °C 左右；而对于微囊藻复苏所需光 强阈值的研究并无定论，国内 外专家较多的关注于底泥黑暗环境下的模拟研究，对于弱光 照度影响藻类复苏的研究棋少。 复苏的影响因素是多方面的，而低温低光条件是铜绿微嶷 藻越冬及复苏过程中必须经历的环 境条件， LI 前对低温低光共同作用下，铜绿微囊藻的生 理响应的研究较少，因此对这一领域 的探索性研究有利于揭示水华种源越冬及复苏的生 物学机制，对水华暴发的初期进行预测预 警也有积极的指示作用。1.蓝藻及蓝藻水华1.1 蓝

13、藻概述蓝藻(blue-green algae蓝藻乂称蓝绿藻，或称蓝细菌，没有细胞核但是具有真核生物中进行光合作用的主要色素叶绿素a,并在光合作用中释放出氧气(孔繁羽，2007),包 括有两个光合系统(Carr & Whitton, 1982),是一类能够进行光合作用的最原始的原核生 物，在分类学上隶属于蓝藻 门(Cya nophyta),蓝藻化石证据表明，蓝藻可能是地球上最早进行放氧光合作用的生物(Wilmote,1994)。蓝藻形态各异，通常按形态可分为单细胞、无分支和分支丝状体，一些丝状体种类具异形胞 (heterocysts)(Tandeau & Houmard, 199

14、3)。 1.1. 2 蓝藻水华及成因水华，亦称水花(water-bloom)，通常是指淡水池塘、河流、湖泊、水库等水体受到 污染， 氮、磷等营养物质大量增加，致使水体富营养化或严重富营养化状态，在一定的温度、光照等条件下，某些藻类发生爆炸性的繁殖，引起明显的水色变化，并在水面形成或薄或厚的绿色或其它颜色的藻类的漂浮物现象(周云龙等，2004)o 一般藻细胞浓度达到20000个/ml,则认为发生水华(SchynsG Jia L,CoursinT, 1995),般认为水华的发生首先 是水体中的营养物质(如氮、磷等) 过量增加，致使水体达到富营养化状态，这是水华现 象的最重要的物质基础。 (金相灿等

15、， 1990 ) o 水华已经成为全球性环境问题。(Carmichael, 1994)o 目前，除南极洲外的世界六大洲都曾报道过水华的暴发。水华可由一 种或 多种藻类组成，在我国绝大多数富营养化水体中发生的是微囊藻水华，例如滇池、太湖、巢湖等大型湖泊，而其中乂以铜绿微粪藻(Microcystis aeruginosa占绝对优势。微粪藻之所以能形成优势种水华是与它自身特殊的结构特点与生理特性是密切相关的：首先在结构上，微囊藻细胞壁外被胶质鞘， 山于有这层胶质鞘， 尽管微囊藻体内蛋口质高达 49.7%, 生物可利用性也受到极大 的限制；其次在微囊藻细胞内部有一种特殊的伪空胞结构，可调 节身体在水体

16、中的浮力，使身 体在水层中发生垂直移动，这种活动具有一定的昼夜节律性 和季节节律性 (孙慧群等， 2005),从 而获得最有利于生长的光照强度 (ReynoldsCS, Oliver RL, WalsbyAE,1987, Oliver R L, Ganf G G.2000)o微粪藻生长与形成分为 4个阶段:休眠、复苏、生物量增加和上浮、形成水华，其中生 物量增加和上浮是水华爆发的关键阶段，这 一阶段很大程度上取决于伪空胞的功能，第三，微 囊藻能分泌一种酸性多糖物质到体外， 并形成耳厚的胶被，胶被的增加使细胞群体随之变大， 有效增强其对浮游动物牧食的抗性 , 并且胶鞘为微囊藻细胞提供了低氧化还原

17、的微环境 (SirenkoL AJ972),使微粪藻避免环 境中的高浓度氧的危害(Gusev MV. 1962, Sirenko L AJ969),第四,微囊藻 具有高效吸收 利用外源无机碳的机制一二氧化碳浓缩机制(Shapiro J,1973)o笫五，微囊藻的次生代谢 产物微囊藻毒素(microcystins)能抑制其它藻类(Hu et al., 2005)其至某些高等植物的光 合作 用(Abe et al., 1996),此外当外界环境不利于生长时，微囊藻会发生沉降或者通过越冬机制而适应恶劣环境，以上的这些生理特性都决定了微囊藻能在自然水体中生存并成为优势种群。1. 2 铜绿微囊藻的形态特

18、点铜绿微囊藻(Microcystis aemginosa kiHz)属于蓝藻门，色球藻 LI色球藻科微囊藻，是占 藻类 绝对优势的种类，干燥寒冷的气候条件促使铜绿微囊藻通过形成砲子来越冬，到了初春季节才开始萌发。它的幼期是一种球形、亚球形或长筒圆形而中实的藻体，胶囊不明显；成长的群体多分裂成网状或窗格状，群体团块肉眼可见，呈橄榄绿色或铜绣绿色；成体除有明显的群体胶製外，各个细胞还有自身的胶囊，这种胶粪呈圆形或多角形。 (董耐成,2002) 1. 3低温低光对 微囊藻生长的影响1. 3. 1 温度的影响温度是促进藻类生长最基本的环境因子 (孙慧群，朱琳，高文宝.,2005), 10 C°

19、;下微囊 藻可以 维持7d的缓慢生长，之后生物量快速下降(李杰，2008),中科院利用滇池湖水所做 的“温度对微 囊藻生长影响”试验显示在秋季随着水温下降，微囊藻生长繁殖减缓，15°C以 下微囊藻停止生长繁殖 (Robarts RD, Zohary T. Temperature effects on photosynthetic capacity, respiration, and growth rates of bloom-formingcyanobacteria. New Zeal J Mar Freshwat Res, 1987,21(3): 391-399.)另, 有研究表

20、明对于水华微囊藻,其生长速率在10-28 °范围内随温 度升高而增大，当温度低于 13°C时，细 胞生长停止，当温度达到16°C时，细胞开始缓慢生 长，当温度达到20°C时，微囊藻生长较快(金 相灿， 2008)<>温度与藻类复苏有很大的影 响，所谓复苏是指蓝藻中的微囊藻在生长环境不利时 会在底泥表面积累，进入休眠状态， 等到环境条件适宜时，开始生长，迁移到水中的现象。冬 季里藻类处于休眠状态，Thomas & Walsby认为当温度上升到7°C左右时，微囊藻在湖泊底泥表 面开始缓慢生长 (Thomas R H, Walsb

21、y A EJ986), Reynolds (1973) 提出，当水体的温度达到 7? 8°C 时，微囊藻群体在底 泥中开始初期缓慢的生长；微囊藻群体在15°C时，生长速率增大，并且开始少量地迁移至 水体中，李阔宁证实微囊藻在底泥中开始生长所需要的最低温度为10°C,当温度上升到15°C时，底泥中的微囊藻群体开始从底泥中释放进入水体，在20°C时大量释放进入水体。而陶益 (2005)等以采自太湖的底泥中微囊藻作为研究对象，发现底泥中微囊藻进入水体 的最适温 度为1820°C,因南北的地理因素不同，复苏所需的温度也不相同，但是基本都是在1

22、0。( 3左右，且当温度继续上升到 15。( 2以上时，它们开始向上进入水柱中生长(万能，2008)o铜绿微囊藻是南湖湖水体中盛夏季节最常见的、占藻类绝对优势的种类。一般以无性繁殖为主，进行细胞分裂、植物体分割和泡子形成等。当环境条件适宜、营养丰富时 , 藻类以细胞分裂的方式增加藻类个体数訂的速度是很快的，但是入冬，北方干燥寒冷的天 气及营养不足等不利条件促 使铜绿微囊藻通过形成抱子来进行越冬，到了初春季节才开始 萌发。他子在细胞内形成的，先 是核的分裂、随着是细胞质的分裂，结果在一个母细胞内 产生 2, 4, 6, 8个小细胞，即抱子。董耐成在铜绿微囊藻越冬抱子萌发研究的实验中 , 通过设置

23、不同的温度来探讨抱子萌发与温度的 关系，从实验中我们发现：于不同温度下（8,10,12,14,16, 20 C）经过12天的培养，南湖冰下水体中的越冬砲子数由原来的 80%以上, 降到 5. 0%以下。试验表明：当营养条件和其它环境条 件充分时，温度因子可以刺激藻类 越冬抱子的萌发。但是温度不同，泡子萌发规律有所差异。从12°C开始，一直到20°C ,抱子萌发速率明显比8°C和10°C时的萌发速率快，前者在 4日之内 泡子减少了 50%以上，而后者则在15%以下，因而当南湖实际水温达到10? 12°C时，至少在4日之内， 应及时采取杀藻措施，以

24、达到有效杀藻，防止“水华”发生。另外，如果在湖体解冰 前, 泡子尚未萌发之际，将抱子数消灭至最低限，也可以起到防息于未然的效果。能否早日解决这些问题，也是彻底解决湖泊富营养化问题的关键（徐锐贤 ， 1999） 。（6）2 光照的影响1. 3. 2. 1 光照强度的影响光照是是影响藻类生长繁殖的重要的生态因子之一，也是其生长的主要能量来源。在一定pH、温度和营养条件下，光照的强弱和时间的长短决定着单细胞藻类光合作用的效率，对藻类的生长速率亦起着至关重要的作用（吴旭，2008）v 在BG-11培养基中,光照度43001X 最适宜铜绿微囊藻生长 , 这与林毅雄等在自制培养基以及灭菌滇池灰弯湖 水中培

25、养铜 绿微囊藻的试验结果相近 （400050001X之间卩最高）.当光照度v 43001X时，随着光照度 下降，铜绿微囊藻生长趋势减缓 ; 当光照度 W4701X 时，铜绿微囊藻生长受到明显 的抑制， 卩值显著下降，不到43001X时的50%;光照度 W1201X时屮则为负值，藻细胞密度呈 衰亡趋 势（陈雪初，2007） o刘玉生（1995）指出在100032001x范围内，光照对藻类的 影响较大， 在 32001X 左右，增殖速率最大。以此为转折点，藻类增长曲线后部趋于平缓 , 说明 30001X 是最适宜的培养光照。当光强处于较弱光强5001ux时，铜绿微囊藻的生长速度 慢，低光照度能对铜

26、绿微囊藻增殖起到抑制作用 . （张丽霞， 2009） 。1. 3. 2. 2光谱成分的影响微囊藻在白光下的生长速率最快，可见白光对藻的细胞生长有明显的促进作用，而红光和蓝光对藻的光合作用有促进作用，能积累更多的光合产物和干物质，所以其叶绿素含量较（7） 低温低光对微囊藻光合活性的影响1 温度叶绿素分子通过直接或间接吸收光量子得到能量后，从基态跃迁到激发态，处于激发 态的 叶绿素分子通过释放能量回到稳定的基态，当它释放出一个光子回到基态，即产生荧光( 万能，2008)o 植物叶绿素荧光在许多研究中被用作评价光合作用过程和不同环境因 子对光合能力影响 的指标，叶绿素a荧光的可变部分(Fv)与最大荧

27、光(Fm)的比值可显示光系 统II的光化学效率，是 使用最广、使用频率最高的一个参数。在正常生理条件下，它是一 个稳定的值，藻类一般为 0.65 (Koiberet al., 1988)。在正常条件下该参数变化极小，不受物种和生长条件的影响，逆境下该参数明显下降。当微粪藻群体被从适宜的生长温度转移至低温(<15°C)时，Fv / Fm的比值降低，说明光系统I【的光化学效率降低，微囊藻群体长期处于低温环境中，光系统II受到一定的损伤，但仍然具有活性，当环境改变，对生长 有利时，光系统 II 的活性开始恢复 (李阔宇， 2004)。梁 英(2008)指出温度为 5? 20 

28、6;C 时, 各荧光参数与温度的相关性与培养天数有关，培养天数为 1? 5d时,三角褐指藻的Fv/Fm与温 度呈极显著的正相关关系；培养天数为1? 4d时，ETR与温度也呈显著的正相关关系：培养天数为810d时，Fv/Fm. ETR呈显著的负相关关系。温度为20?30 C时，在整个培养周期 中，三角褐指藻的荧光参数 ETR与温度呈显著的负相关关系；培养天 数为1? 5d和9? 10d时,Fv/Fm与温度呈显著的负相关关系。2 光照当藻类处于不适宜的光照强度时，光系统就会受到不同程度的损伤，从而造成光合能力的下降，一般认为，当光强低于半饱和光照强度时，光损伤会明显加剧(陈莲花， 2007)o 自

29、然环境的光强范围内(6.5? 2000 MmolmAs-1),藻类光损伤速率与光强呈直线关系(Tyystjdrvi&Aro, 1996)。光损伤在所有光照条件下都会发生，低光下也不可避免，不同的是其发生的光损伤机制不同于高光下的受体侧损伤，是一种供体侧损伤，也称之为“低光综合症"(low light syndrome) (Ohadet al., 1994; Keren et al., 1995, 1997)。此外， Krause (1994)认为低温还能加剧光损伤，也有研究认 为(Sakamoto & Bryant, 1998)低温对藻 细胞主长的影响并不是山光合作用

30、抑制引起，而可能是山 于营养缺乏引起的，低温下营养缺乏可能会损害其多种生理活动。当光强处于10|.imol m'2? s"与40pmol ? mJ ? s'1时，Fv/Fm的 值均比较高，一直保持在 0.45左右，说明此光照条件下有利于微 囊藻的生长。与此相反， 在光强 320Mmolm2-s-,M 件下，铜绿微囊藻的 Fv/Fm 值笫 1 天就显著降 低，至第 4 天起才稍微 升高，说明强光显著影响了铜绿微粪藻 PsII 的原初光能转化效率。当光 强处于IGOpmol mA s1时铜绿微粪藻Ps II的原初光能转化效率也明显降低。较弱的光强5001ux虽然 对叶绿素

31、荧光参数 Fv / Fm 没有影响，但是却影响了藻的光合速率 (张丽霞， 2009),说明 在 不同光强下，铜绿微囊藻叶绿素荧光参数均有明显的变化 .1. 5 实验有关生理指标1. 5. 1叶绿素a的测定釆用 80%的丙酮提取，比色法测定。取样品 (Va=10mL) 于 10mL 的离心管中，经 4000 r/min 离心15 min,弃上清液，下层藻体重新悬浮于80% W酮(Vm=3mL)中，密封后于 4°C、黑暗条件下储藏过夜：再经4000 r/min离心15 min,取上清液，以丙酮作为参比 液,分别测定上清液在646 nm 和 663 nm 下的吸光值，单位： mg/Lchi

32、.a (mg/L) = 3.663A663 -0.843A646 ;1 . 5.2光合活性相关指标Fv/Fm是PS II的最大光化学量子产量，乂叫做原初光化学的最大产量、PS II光化学反 应的潜在产量、 PS II 潜在最大量子产量等，它反映的是当所有 PS II 反应中心均处于开放态 是的量子 产量，是使用最广、使用频率最高的一个参数。在正常生理条件下，它是一个稳定的值，藻类一般为 0.65 (Kolber Z, Zehr J, Falkowski PG.1988, Duysens LN M, Sweers H E,1963)o光合速率一般用放氧速率或 CO2固定速率表示，也可用ETR来表

33、示。光合作用中P-I曲线,反 映了光合作用随光强的变化，在一定光强范围内，该曲线为一条饱和曲线，即随着光强的增大而上升，最后达到最大值 ( 万能， 2008)测定有效光化学的量子产量 Yield,根据公式Y=(Fnr-Ft)/Fnf系统就可自动计算出 丫值，它反映 了植物在当前光照下的实际光合效率。2. 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 材料实验所采用的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)山中国科学院水生生物研究淡水藻种库提供，编号 FACHB 905o2 . 1 .2主要药品试剂95%酒精，鲁哥氏液(将6g碘化钾溶于20ml蒸馆水中，待完全溶解后加入 4g碘摇匀，待

34、 碘完全溶化后加 80ml 蒸憾水)，蒸傑水、80%丙酮主要仪器Water-Pam （MINI-PAM,德国），立式电热压力蒸气灭菌锅（LDZX-30,上海），光 照培养箱（SPX-150-GB,上海），移液枪（Eppendof,德国），超净工作台（SW-CJ-ZD,苏州），高速离心M（ Anke TDL80-2B,日本），分光光度计（UNICO UV-2000,北京）2.2实验方法超净工作台的使用2.2.2 BG-11培养基的配制试剂质量柠檬酸0.06g/L柠檬酸铁胺0.06g/LEDTA0.01 g/LNaNOs1.5g/LK2HPO40.03g/LMgSO4-7H2O0.075g/LNa

35、2CO30.02g/LCaCb-2H2O0.036g/LA5先配制母液，然后稀释使用。其中A5包括H3BO3 2.86 g/LMnC12-4H 2O 1.81 g/LZn SO4-7H2O 0.222 g/LNa2MnO4-2H 200.391 g/LCUSO4-5H2O 0.079 g/LCO（N03）2-6H200.049 g/L2.2.3 M. aerugi nasa FACHB 905 的扩大培养实验前先将M. aeruginasa FACHB 905扩大培养至2L。此操作过程必须在超净工作台上，无菌的状态下进行。使用前应打开紫外灯30分钟，使用时应关掉紫外灯打开通风，手和所有使用的器

36、材必须用酒精棉球擦拭才能放到超净工作台上。取藻样时，必须必须在酒精灯外焰的周圉操作。实验结束后应该把所有器材以及藻样全部拿出去，并用酒精棉球将台面以及周围擦拭干净，确保通风等都关闭后，拉上有机玻璃门。实验开始时，取27个500 ml的三角瓶，每个三角瓶中倒入 400 ml的培养基，加入适量 的 处于对数生长期的藻样，使其藻样密度控制为OD665=0.09o本实验设置三个温度梯度：15°C、12 °C、9°C,三个光照：10uEm-2s 5uEm-2s- 2uEm-2s-1，在温箱内通过控制温度 和适当遮光处理进 行全面正交实验。、八度光照、15°C12&

37、#176;C9 °C10uEm2s4三瓶三瓶三瓶三瓶三瓶三瓶2uE nfs-1三瓶三瓶三瓶将藻样放在设置好的光照培养箱和冰箱中，每天从每瓶中取出12ml, 10 ml用于测藻的生 物量，lml 测 ETR 及 Yield 的变化，1ml 测 Fv/Fm。2.3藻的生物量叶绿素a测定藻的生物量釆用80%的丙酮提取，比色法测定。取样品(Va=10mL)于10mL的离心管 中， 经4000 r/min离心15 min,弃上清液,下层藻体重新悬浮于 80%丙酮(Vm=3mL)中,密圭寸后于4°C、 黑暗条件下储藏过夜；再经 4000 r/min离心15 min,取上清液，以丙酮 作

38、为参比液，分别测定上 清液在646 nm和663 nm下的吸光值，单位： mg/Lchl.a (mg/L) = 3.663A663 -0.843A646 ;藻的光合活性的测定M. aeruginasa FACHB 905光合活性的测定使用了 Water-PAMo取约0.5ml的藻液并加入 2ml左右的蒸谓水，将此混合液倒入3ml的玻璃测试管中，观察Ft的值是否处于200到500之间， 若是不在此区间需在调整藻液和蒸镭水的比例，直到处于这个区间内，首次调整后，按首次藻液和蒸憎水比例测定所有的藻液的ETR及Yield的变化撚后将藻样暗处理 15min后，测定Fv/Fm的值。Water-PAM数据测

39、定时的参数设置如下图：图1. Water-PAM参数设左 FigWater-PAM Parameter sett ings所有的藻样都必须每天在相同的测一次，直到 状态并且保持稳定，可以结束实验。18个周期后结束观察各个数据，如果达到稳定的3.研究结果3.1低温低光条件下905生长的变化905在15 C条件下，各光照组均显示出相对较咼的生长速率，生物量逐渐增加，最大生物量(chl.a)为0.74 mg/L。在12 C各处理组中，905生长缓慢，且在光强为 2 pE/m2s处 理组中，微 囊藻的生物量后期呈下降趋势。与此相对，在9 C各处理组中，微囊藻的增殖 受到明显的抑制，生物量逐渐下降，且光

40、照强度对 905生长的影响无显著差异。(7?吕咒一五iI1 IrS 12 1B 204- 1 g*C *； c-9*C图1.低温低光对FACHB 905生物量的影响Fig.1 Biomass of FACHB 905 under low temperature and low light intensity3.2低温低光条件下光合活性的变化荧光量子产量(Yield)微囊藻细胞光合活性对低温和低光的响应差异较为显著。在15 °C各处理组中，Yield在实验初期2-3天内，呈现显著下降趋势，在随后的实验过程中逐步大幅上升。12 °各处 理组中，Yield也呈现波动起伏，但在后期

41、略有下降。9°C各处理组呈现较明显的下降趋势。但不同温度处理组中，10 pE/nrs光强下905细胞Yield都显著低于2 pE/nrs光强组。电子传递速率(ETR)在15 C处理组中，905细胞的ETR变化趋势与Yield 致，在实验前期2-3天中呈下降趋 势，然后逐步大幅回升。12 C处理组中ETR基本保持稳定状态，但随光强降低，905细胞ETR呈现略微增长的负相关变化，即 2 pE/nrs > 5 pE/nrs > 10 pE/nrso但9 C各处理组中，ETR均呈现不同幅度下降，最低光强组中(2 pE/m2s) , ETR逐步缓慢下降至2.8 pmol elect

42、rons/nrs ；而相对高光 强组中(10 pE/nrs) , ETR首先大幅下降，后期略有升高,最后为0.9 pmol electrons/m2s仅占低光强组的 32.1%。O 4 S 12a -1 5 伫；b-1 2 C ;2 0 0431 21 620 041 0 uEa5 UE亠2 HE?daysc-9 C图2.低温低光对FACHB 905 Yield值的影响Fig.2 Yield of FACHB 905 under low temperature and low light intensitydays图3?低温低光对 FACHB 905 ETRm的影响Fig.3 ETRm of

43、FACHB 905 under low temperature and low light intensity最大可变荧光(Fv/Fm)Fv/Fm也在初期呈现下降的趋势，随后在各不同温度和光照处理组中差异显著。15 C处理组中，Fv/Fm 上升幅度最大可变荧光参数均在数天之后表现出大幅上升趋势，且相对高的光强处理下 小于相对低光强组。 12 °C 各处理组中， Fv/Fm 在前期出现略微下降后， 后期表现较为一致，最终基本稳定于0.35左右。在9 °处理组中，2 pE/m2s光强处理下的905细胞表现出与12 C处理组类似的变化，而相对高的光强不利于Fv/Fm维持稳定，呈现

44、急剧 下降的趋势，但实验后期仍能部分恢复。ELL2F I E u- u UIT 1IIIIIII1e 23 Q43121e 20 04£daysa-lEt： ;b-12 t： ：c-9匕图4?低温低光对 FACHB 905 Fv/Fm的影响Fig.4 Fv/Fm of FACHB 905 un der low temperature and low light inten sity4. 回复实验在置于常规条件下恢复生长过程中，各处理组905细胞均显示出了快速增长的趋势。尤其12 C,9 C处理组中在回复生长的第 3天藻液山黄色转为绿色。且除 15 C处理组中Yield略有下 降外，其

45、他各组均大幅增长，但后期各组Yield值均恢复到0.55-0.6之间。ETR变化趋势与Yield 相似，均在后期恢复到正常条件下培养的状态。PAa2 3C°c-9C°daysa-15 °C; b-12图5.回复培养条件下各处理组的YiJd值变化Fig.5 Variations of Yield in FACHB 905 under normally reculturef - 10 nE 一 5 uEd aysa-15 C：bX2 C：c-9 (图6?回复培养条件下齐处理组的ETR变化Fig.6 Variations of ETR in FACHB 905 unde

46、r normally reculture5.讨论与分析5. 1低温低光对铜绿微囊藻生物量的影响在此实验中，温度是905细胞增长的首要因素。905细胞的生物量依次为 9 °<12 °C<15 °C, 且在15 C, 2 ME/m2s下微囊藻生物量最大，显示出在低温下，微囊藻细胞对“相对高”的低光更为敬感；12 C条件下，905细胞能维持生长，但生物量增加缓慢：而在9 C条件，光照强度不能成为影响微囊藻增殖的环境条件，微囊藻生物量在所有处理组中都呈逐渐下降趋势，尤其在中后期生物量迅速下降，这与李杰等人的实验结果一致。Fall on et al也证实在野外湖

47、泊中，水温超过10°C,微囊藻即可开始缓慢生长，与本实验结果相似。由此，我们可推测微囊藻的生长温度最低阈值应大于9 C,而12 C, 2 ME/m2s的协同作用极有可能为微婪藻春季复苏的起始环 境条件。5. 2 低温低光对铜绿微囊藻光合活性的影响905细胞Yield值和ETR变化趋势类似，在实验初期均出现下降趋势，但12 C温度下各处 理组下降幅度远低于15 °和9 °各处理组。通常在实验藻种扩培时，均采用的常规培养条件，但在实验开始时，藻种被转入实验条件下， 111 于温度和光强的突然变化，会在前期出 现适应 性调整，在本实验中表现为光合活性的下降。 Wane/

48、M 通过在滇池的原位实验已证 实铜绿微囊 藻细胞在进入底泥环境后光合系统和抗氧化系统均出现类似变化 (Wan N, Tang J, Li QM,2008) ： 而 Wu et al 也证实了群体微囊藻和单细胞微蛭藻在黑暗、低温环境中也会发生这一变化 (WuZX,2008),这都与我们的结果一致。在后期的实验过程中，905细胞的Yield和ETR在不同处理组中还表现出较大的差异，其变化趋势与微囊藻细胞的生长趋势一 致，温度成为影响光合活性 的限制性因子。但同一温度条件下 PS II 活性均与光强成负相关 , 即“微光”条件下的实际荧光 量子产量高于“低光”条件，相对电子传递速率也表现出相似规律。

49、在15 °C处理组中差异尤为显著，“低光”组 Yield 仅占“弱光”组的 58.5%,而 ETR 约为 64.7%,这一结果显示在 15 °C 低温条件下，905细胞对相对高的光强耐受性较低，与Yin etal对另一种水华蓝藻集胞藻的研究相吻合。Fv/Fm 是衡量光化学效率的重要参数，通常情况下，仅存在种间差异，所以被用来表征生理胁迫下的光系统变化。本实验中， 12°C 各处理组中，光强对 Fv/Fm 的影响无差异， 在经历 3d 左右的适应期后，逐渐回复，并追逐稳定于 0.347+0.009附近。在另两个温度处理 组中，也 发现了类似Yield和ETR的变化趋

50、势，光强与 Fv/Fm变化呈现负相关，15 C条件下,“弱光”、“微光”处理组的光化学效率在后期逐渐上升至正常水平， 稳定在 0.6左右，但“低 光”组Fv/Fm为“弱光”组61.3%;同比下，9 °C处理组中Fv/Fm最大值为0.35,显示7905细 胞光合系统在此温度下受到了损你且“低光”组(10mE)仅占“微光”组(2応)的36.7%。在藻类生理实验中，回复培养通常用来衡量细胞在受到胁迫后，其生理指标恢复正常水平的能力与速度，受到广泛应用。本实验回复培养 (25 C, 50 mE)结果显示，除15 C处理组905细胞PS II 活性呈缓慢下降趋势外，12°C、9 C两

51、处理组中藻细胞的光合活性呈迅速回复趋势。6. 结论本实验在低温低光的条件下，采用正交试验的方法，研究了低温低光条件下铜绿微囊 藻生 长与光合活性的影响。实验结果表明，在低温低光条件下 M. aeruginosa 905 的生长均 受到不同 程度的抑制作用，在 15°C 条件下微囊藻生物量最大，在 12°C 下，微囊藻生长缓慢 , 且微囊藻 的生物量增加与光照强度呈现明显的负相关，而在9 °C 条件，光照强度不能成为 影响微囊藻增殖的环境条件，微囊藻生物量在所有处理组中都呈逐渐下降趋势，尤其在中 后期生物量迅速下 降，因此微囊藻的生长温度的最低阈值应高于9 

52、6;C。在温度$12 °C时,光照强度开始成为影响微囊藻增殖的主要因子。12°C, 2pE/m2s可能为微囊藻复苏的起始 环境条件。刃外，905细胞Yield 值和 ETR 变化趋势类似，在实验初期均出现下降趋势，这是山于温度和光强的突然变化，会在前期出现适应性调整，在本实验中表现为光合活性的下 降。在后期的实验过程中， 905 细胞的 Yield 和 ETR 在不同处理组中还表现出较大的差异， 其变化趋势与微囊藻细胞的生长趋势一致， 温度成为影响光合活性的限制性因子，但同一温 度条件下 PS II 活性均与光强成负相关，暗示 在野外冬季环境中，光强的增加应对藻体存活 率乃

53、至复苏期的 PS II 活性有抑制作用。实验结 束后，藻体的颜色山淡绿色变为黃色，将藻 样进行回复生长实验时，结果显示 905 细胞在回复 培养中能迅速恢复生长，说明在低温低 光的条件下藻类能保持光合活性，当环境条件有利时， 能迅速恢复光合系统活性。另外， 本实验的研究结果已整理成文低光低温联合作用对铜绿微 囊藻复苏能力的影响并被权 威期刊环境科学接收。参考文献Abe T, Lawson T, Codd G A? MC-LR inhibits photosynthesis of Phaseolus vulgaris primary leaves implication for current

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