基本蛋白质实验

1、 SDS-PAGE Western blotting Southwestern blotting ImmunochemistrySDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：根据蛋白质分子量不同分离复杂蛋白质成分。1.制备凝胶试剂： 丙烯酰胺（单体） 亚甲双丙烯酰胺（胶联剂） 二者比例29 ：1 母液浓度30% 过硫酸铵（引发剂） N,N,N,N-四甲基乙二胺（ TEMED） (加速剂) 十二烷基磺酸钠（SDS）（阴离子变性剂）SDS-PAGE试剂2.蛋白上样缓冲液3.电泳缓冲液 4.考马斯亮蓝R250染色液5.脱色液SDS-PAGE实验过程流程如下： 凝胶制备 蛋白样品制备及上样 电泳 卸胶 染色 脱

2、色凝胶制备 梳子孔分离胶浓缩胶分子量范围与凝胶浓度 分子量范围(KDa) 凝胶浓度范围 100 4%-7% 10-100K 8%-15% 10 20%-30%12% SDS-PAGE凝胶成分（15ml15ml）试剂及浓度 12%分离胶纯水 4.9ml30%丙烯酰胺 6.0ml1.5M Tris-Cl（pH8.8） 3.8ml10%SDS 150ul10%过硫酸胺 150ulTEMED 4ul5% SDS-PAGE凝胶成分（6ml6ml） 试剂及浓度 5%浓缩胶纯水 4.2ml30%丙烯酰胺 0.99ml1.0M Tris-Cl（pH6.8） 0.75ml10%SDS 60ul10%过硫酸胺 3

3、0ulTEMED 3ul蛋白样品制备及上样每个加样孔所上样蛋白总量要适中 过高: :蛋白条带扭曲 过低: :蛋白条带染色浅蛋白样品需与上样缓冲液混合(1:1)(1:1) 2 2SDSSDS凝胶上样缓冲液( (100mM/L Tris-Cl(pH6.8)100mM/L Tris-Cl(pH6.8)， 200mM/L DTT200mM/L DTT，4%SDS4%SDS，0.2%0.2%溴酚蓝，20% 20% 甘油) )上样前样品需要沸煮3-53-5分钟 电泳 上层胶电压小(80V) 使蛋白在浓缩胶和分离胶的交界处浓缩呈线状 下层胶电压加大(150V) 使蛋白样品充分分开 卸胶: 防止凝胶破损染色:

4、 考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝R250 1.25g，甲醇225ml，冰醋酸 50ml，MilliQ水定容500ml。脱色:甲醇150ml，冰醋酸50ml，MilliQ水300ml。Western blotting基本原理: 将SDS-PAGE分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上,在膜上进行固相免疫化学染色,原位显示蛋白质带,从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析。Western blotting实验过程流程如下： SDS-PAGE（不经染色） 电场转移 免疫化学染色电场转移 切下需转移凝胶，再剪下一块与凝胶块等大的硝酸纤维素膜和两块厚滤纸

5、，均浸泡于电转移缓冲液中（25mM Tris，192mM glycine，0.1%SDS，20%甲醇 ） 至少30分钟。然后用塑料框架固定如“三明治”样。凝胶NCM滤纸固定架（ ）（ + ） SDS-蛋白质复合物在电场的作用下向正极移动，达到NCM，以共价键结合在NCM上。 根据目的蛋白分子量大小设定电流（恒流）或电压（恒压）大小。电转移操作时应注意： 凝胶、NCM 及滤纸一定要在电转移缓冲液中浸泡； 凝胶、NCM 及滤纸大小应一致，以防电转时短路（半干转时）； 一定要赶走“三明治”各层间的气泡； 电转移缓冲液中的甲醇（可促进蛋白质与NCM的结合）最好用前加入。 转移完成后，可用丽春红染NCM

6、,观察转移的效果；同时，转膜后的凝胶也可以进行银染或者考染，评价转移的效果。 最好是NCM上可见，凝胶上模糊。 丽春红染色NCM (2-DE)银染转膜后的凝胶（2-DE）免疫化学染色试剂: TBS（100mmol Tris，150mmol Nacl） 复性液 (0.3% Triton X-100于TBS中) 封闭液 (5%脱脂奶粉于TBS中) TBST漂洗液（0.05% TWeen-20于TBS中)免疫化学染色过程: 复性 把硝酸纤维素膜放入复性液中,复性5min后, Milli-Q水冲洗两遍； 封闭 把复性过的硝酸纤维素膜放入封闭液，平放于摇床上室温孵育1-2小时，或4放置过夜； 洗涤 弃去

7、封闭液，用TBST洗涤3次, 10min/次； 一抗孵育 一抗与封闭液按比例混匀后,移至塑料袋中，将硝酸纤维素膜放入其中, 密封塑料袋, 于摇床上室温温育2小时； 洗涤 TBST充分34次,10min/次； 二抗孵育 将辣根过氧化物酶二抗用封闭液稀释后, 将硝酸纤维素膜加入其中,室温摇床上放置2小时； 洗涤 TBST充分34次,10min/次； DAB显色 将二抗孵育后的硝酸纤维素膜放入显色液中,轻轻摇动310min,待膜上可见明显的显色斑点。 Southwestern blotting 该方法是结合了Western blotting和southern blotting两种试验方法而发展起来的

8、检测与特异DNA序列相结合的DNA结合蛋白的方法.基本原理: 细胞核蛋白提取物经SDS-PAGE后,转移至NCM上,然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。 Southwestern blotting实验过程流程如下： SDS-PAGE 电场转移 标记的DNA探针与NCM上蛋白质的杂交Immunochemistry基本原理： 应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞或组织中多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。 组织固定、石蜡包埋、切片、脱蜡 过氧化氢灭活内源性过氧化物酶 微波修复抗原 封闭 一抗、二抗孵育孵育 DAB显色 苏木素伊红（HE）复染免疫组化法一般实验过程K

9、ey points 蛋白质组及蛋白质组学概念 双向电泳的原理 比较蛋白质组学实验流程 几种功能蛋白质组学研究方法的基本原理 Western blotting的基本原理及操作中的注意事项E-mail : 某学生进行蔗糖的水解实验某学生进行蔗糖的水解实验, ,并检验水解产物中是否含有葡萄并检验水解产物中是否含有葡萄糖糖, ,他的操作如下他的操作如下: :取少量纯蔗糖加适量水配成溶液取少量纯蔗糖加适量水配成溶液; ;在蔗糖溶在蔗糖溶液中加入液中加入3-53-5滴稀硫酸滴稀硫酸; ;将混合溶液煮沸几分钟将混合溶液煮沸几分钟, ,冷却冷却; ;在冷却在冷却后的溶液中加入新制后的溶液中加入新制Cu(OH)

10、Cu(OH)2 2, ,在水溶液中加热在水溶液中加热. .实验结果没有实验结果没有砖红色沉淀产生砖红色沉淀产生. .(1).(1).其原因是其原因是( )( )A.A.蔗糖尚未水解蔗糖尚未水解 B.B.加热时间不够加热时间不够C.C.煮沸后的溶液没有加碱煮沸后的溶液没有加碱, ,以中和作催化剂的酸以中和作催化剂的酸D.D.蔗糖水解的产物中没有葡萄糖蔗糖水解的产物中没有葡萄糖(2).(2).其正确操作是其正确操作是: : 。 先加氢氧化钠溶液调溶液至碱性先加氢氧化钠溶液调溶液至碱性, ,再加入新制的再加入新制的u(OH)u(OH)2 2电泳 上层胶电压小(80V) 使蛋白在浓缩胶和分离胶的交界处浓缩呈线状 下层胶电压加大(150V) 使蛋白样品充分分开 Western blotting基本原理: 将SDS-PAGE分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上,在膜上进行固相免疫化学染色,原位显示蛋白质带,从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析。Western blotting基本原理: 将SDS