仪器分析第三讲ppt课件

1、扫描电镜样品制备的几个问题扫描电镜样品制备的几个问题 临界点干燥临界点干燥1.1.原理原理根据分子物理学，理想气体的状态方程为：根据分子物理学，理想气体的状态方程为：为绝对温度为气体常数，为气体分子量，为气体质量，为气体体积，为气体压强，其中：TR M V P RTMPV 将上式变换后即:RTP 在一定温度下，有等温线如图。在不同温度下的等温线如图。 图中oa段，P随的增加而增加，近似于理想气体。ab段为气液共存，压强保持在饱和蒸汽压. a点的密度为该温度b点的密度为该温度下气液共存时的液体约密度。ab之间各点，表示气液可以按比例共存，相当的值代表该状态下相应的密度。bd表示全部液化后，随压强

2、的增加，密度仅有缓慢的增加，表明液体难以被压缩。 在不同温度下，实际气体的等温线如图所示。温度较高 (T3)时，近于理想气体；温度较低(T1 ,T2 )时，有液化过程。温度越低，液化过程越长。温度逐渐上升，液化过程越来越短，到达一定温度，可缩短为0。 在此温度下，气体到液体的转变是突然的，两者的密度相等，如图中的c点。这一温度称为临界温度(Tc)。c点的压强，称为临界压强(Pc)。因此，物质的临界温度就是对该物质加压时能液化的最高温度。高于此温度时，无论对该物质施加多大压强，它也不被液化。物质的临界压强就是它在临界温度下，能被液化所需施加的最小压强。低于此压强，该物质是气体；高于此压强是液体。

3、在临界状态，界面消失，液气共存，而且两相的密度相等，表面张力等于零。若在此时干燥标本，则标本不会受表面张力的损伤。生物组织含有大量水，若于固定后在水的临界状态下进行干燥，生物组织定遭破坏。目前国内外实验室几乎都用C02为工作介质进行临界点干燥。 2.临界点干燥操作 图示意二氧化碳临界点干燥装置。标本经过固定及脱水后(如用乙醇脱水，往往再用醋酸异戊酯浸泡，将乙醇置换)迅速放入耐高压的样品室中，然后充以液态CO2，使CO2液体占样品室容积的50一80然后升温，使温度超过CO2临界温度，达400C左右，压强超过其临界压强，达100大气压左右。在此过程中，C02经过全部液化然后突然全部气化，成为400

4、C左右的气体，最后等温放气，降到大气压。待温度降到室温后，即可取出干燥的样品。整个干燥过程CO2的物态变化如图所示。在温度To(一般低于室温l00C)充CO2，样品室中CO2的状态从1(此时压强为l大气压)升压到2，再液化到3，这是等温充液过程，压强增大。由于CO2质量增加，密度增大。在由To升温到Tm的过程中，物态由3到4，即升温升压液化过程。到4时全部液化，由4到5，C02液体升温到临界温度Td，经过5时，C02液体全部同时转变为C02气体而不出现气液界面。由5到6，气体升温到Tm。此时等温放气，物态由6到7，此时压强降为1个大气压再降温到室温，物态到7到8。由l到8就是样品室中工作介质C

5、02物态变化的全过程，由物态变化全过程的分析来看，临界点干燥的关键步骤是由3到6。即必需全部液化再全部气化，才能避免气液分界的出现，克服表面张力对样品细微结构的损伤。 3.临界点干燥失败的原因临界点干燥法固然是个好方法，但操作有误也会失败。常引起的原因如下： (1)C02量不够；一般C02液体应充至样品室的50一80。若C02充量不够，样品室中的C02密度小于c，则升温气化时物态将沿c点左侧的3、4、5、6竖直线变化。由3到4不是液化而是气化，到4点，全部变为气体。这样便不是临界点干燥，而是类似自然干燥。 (2)样品上粘附酯酸异戊酯过多；由于醋酸异戊酯不易挥发，C02气体排出后，样品室便留有残

6、余的醋酸异戊酯，因而干燥不充分。 (3)样品室封闭不严密；由于干燥前未拧紧放气阀，或放气阀橡皮垫圈不紧，或由于样品室盖橡皮垫圈老化等原因，导致样品室不能密闭，使充入的CO 2泄漏，其后果与I相同。 (4)待干燥样品量过大，这一方面把多量醋酸异戊酷带入，另一方面盛样品的小金属盒在样品室占据的空间过大，使C02量相对不足，因而干燥不充分。 二、真空干燥法二、真空干燥法 样品按普通扫描电镜标本制备方法进行固定和乙醇系列脱水，然后将样品按普通扫描电镜标本制备方法进行固定和乙醇系列脱水，然后将其由其由l00l00乙醇移至乙醇移至100100乙醚中，再将样品投入装满液氮的高约乙醚中，再将样品投入装满液氮的

7、高约5cm5cm的金的金属杯中使之冷冻。把装有冷冻样品的金属杯放入真空装置中，用旋转泵属杯中使之冷冻。把装有冷冻样品的金属杯放入真空装置中，用旋转泵抽气。由于在封闭空间体积不变的情况下，压力降低会引起温度下降，抽气。由于在封闭空间体积不变的情况下，压力降低会引起温度下降，液氮变为固态氮并且升华。然后样品中的乙醇也升华，样品干燥。液氮变为固态氮并且升华。然后样品中的乙醇也升华，样品干燥。 可以用乙腈干燥标品，其步骤如下：样品按一般方法固定，用浓度递可以用乙腈干燥标品，其步骤如下：样品按一般方法固定，用浓度递增的乙腈系列增的乙腈系列(50(50一一100100) )脱水脱水 ( (每次脱水时间需每

8、次脱水时间需20mln)20mln)。用容量约。用容量约1m11m1的铝制容器装满乙腈，把已脱水的样品放入。将该容器放入真空装置的铝制容器装满乙腈，把已脱水的样品放入。将该容器放入真空装置中。抽真空，容器骤冷，乙腈成为固态。继续抽真空时乙腈升华。样品中。抽真空，容器骤冷，乙腈成为固态。继续抽真空时乙腈升华。样品枯燥。枯燥。四、样品的冷冻处理 为了减少冰晶对组织的损伤，在冷冻前可用冷冻保护剂处理标本。冷冻保护剂有PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、甘油、蔗糖、二甲基亚砜等，各有优缺点，根据不同组织选用不同的浓度和处理时间，PVP用15一20，甘油用20一30，二甲基亚矾用20一30，蔗糖用(052. 3M

9、olL。实际上蔗糖主要是使生物织织部分脱水而减少冰晶。处理时间1030min 由于液氮的冰点及沸点很接近。当组织块进入液氮中时，最先接触到组织的液氮温度升高而气化，致使组织块表面被一层气泡层包围，起到绝热层的作用，这反而大大降低冷冻速度，影响结构的保存，因此不常用。 (1)利用金属材料的良好才热性能，预先将金属块放入液氮中冷却，待冷到与液氮相同的温度后，将小块组织与金属面接触而使其迅速冷冻，由于避免了液氮绝热层的影响，故冷冻效果较好。与组织接触的金属表面要求持别光洁，另外，组织与金属相互接触时的压力、速度也要控制好，否则会使细胞结构受形。 (2)使用致冷剂冷冻组织。组织不直接由液氮冷却而是先将

10、某些致冷剂用液氮冷却到稍稍高于其冰点的温度，然后将组织块迅速投入致冷剂中冷却，由于这些致冷剂的沸点高、溶点低，因而避免了液氮冷却时产生的绝热影响。常用的致冷剂有丙烷、异戊烷、F12 F13、F22等。 五、组织导电技术 组织导电技术可避免金属镀膜法由于抽真空和热辐射等因素给生物样品带来的损伤。其原则是利用重金届盐类化合物，与生物组织内的蛋自质、脂类等物质起化学结合，以达到样品表面离子化，增强样品导电率和减少充放电效应。组织导电法还可以加强固定效果减少组织变形损伤及增加样品对电子轰击的耐受力。经过组织导电和常规脱水处理后的样品，可直接进行SEM观察。组织导电法不仅适用于动物组织，而且也适用于植物

11、样品，因此，这一技术披认为是种简便有效的导电处理方法。常用的组织导电法： (1)单宁酸饿酸法：将经过常规取材固定的样品，放进2单宁酸或该液与4戊二醛混合液中212h，期间换液二次，漂洗后将样品放人2一4饿酸中30 min至数小时，经梯度脱水、临界点干燥处理，SEM观察。（2硫卡巴肼饿酸法(OTO)法)：样品取材后用1娥酸固定30一60 min。经充分漂洗，将样品浸泡于硫卡巴肼二氨基硫脲过饱和水溶液1030 min，水洗15min(重复23次)以后，再次用1饿酸液固定3060 min。最后脱水、枯燥。 (3) 碘化钾一醋酸铅组织导电处理 将组织用适当的固定液固定， 并将多余的固定液清洗掉。 将组

12、织转入0.2(WV)碘化钾(含02克碘)溶液中，于室温下处理2分钟。 用重蒸馏水清洗组织3次，每次1分钟。 将组织转入临用前以3倍蒸馏水稀释并过滤的04(WV)氢氧化钠、012(wV)醋酸铅水镕液中，于室温下处离3分钟。 用重蒸馏水洗去多余的混合镕液。 按常规程序脱水、临界点干燥、喷镀导电层。 六、戊二醛的纯化 戊二醛是种五碳醛，含有两个醛基。30以上浓度的戊二醛易聚合，市售的戊二醛通常为25或50的水溶液，含有较多杂质。新处理过的戊二醛为无色或很谈的黄色。对纯戊二醛(戊二醛单体)进行紫外分光测定时吸收峰为280nm。长期存放的戊二醛可发生聚合，产生杂质,由于戊二醛中的醛基易氧化为有机酸，使p

13、H下降。当pH下降至3. 5以下时，就失去固定能力，需要纯化。纯化的方法有蒸馏及用活性炭处理等方法。 1.活性炭提纯的方法是在市售的戊二醛溶液中按每l0L1g的比例加入活性炭，在4下摇动1h以上，然后过滤。测pH，在pH4以上即可使用。如pH在4以下、可用活性炭重复吸附2次。 2.此外，还可用碳酸钡吸附法提纯，做法是100m1戊二醛中加2g碳酸钡，摇动510min，然后过滤备用。 3.低压蒸馏法(压差10-17mmHg， 温度60800C) 可以得到很纯的戊二醛蒸馏物。这种纯的蒸馏物极不稳定，必须立即用适当体积的煮沸过的重蒸水在磁力搅拌器上(70800C)稀释成50或25的水溶液避光低温保存。低压蒸馏装置如图。 1参照图组装减压蒸馏装置，但还须在盛干燥剂的干燥瓶出口加装一封闭式水银压力计，用来测量干燥瓶内气压。 2将待处理戊二醛例入圆底烧瓶，放入沸珠数粒， 3开启水管，使之进入冷凝管进水口。 4接通电源，开始加热。 5开启真空泵，抽气。 6观察磨口温度计，开始蒸馏收集的是水，当温度达650C左右时，停止加热，打开排气管待压力平衡后，关闭真空泵，并取下接收瓶。 7取另一接收瓶，内装煮沸冷却的双蒸