吸光光度法新改

1、1四川农业大学四川农业大学15.5 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择15.4 显色反应和显色条件的选择显色反应和显色条件的选择15.3 分光光度计分光光度计 15.2 光吸收定律光吸收定律15.1 吸光光度法概述吸光光度法概述15.6 吸光光度光法的应用吸光光度光法的应用2四川农业大学四川农业大学15.1 吸光光度法概述吸光光度法概述 利用溶液颜色的深浅来测定溶液中有色物质利用溶液颜色的深浅来测定溶液中有色物质的浓度，这种测定方法称为的浓度，这种测定方法称为比色分析法比色分析法。 用分光光度计进行比色分析的方法称为用分光光度计进行比色分析的方法称为分分光光度法光光度法。15.1.1 光

2、的基本性质光的基本性质 光具有波粒二象性，即光具有波粒二象性，即波动性、粒子性波动性、粒子性3四川农业大学四川农业大学根据波长的不同，可分为：根据波长的不同，可分为： 紫外光区紫外光区：200nm 380nm 可见光区可见光区：380nm 760nm 红外光区：红外光区：760nm 300m 描述其波动性的主要参数是：描述其波动性的主要参数是：波长波长，频率频率 ，光速光速c。三者间关系为：三者间关系为： c4四川农业大学四川农业大学具有同一波长的光称为具有同一波长的光称为单色光单色光。光的光的粒子性粒子性：如：如光电效应光电效应，光的吸收和发射光的吸收和发射等等 即把光看成是带有能量的微粒流

3、，这种即把光看成是带有能量的微粒流，这种微粒叫做微粒叫做光子光子或者或者光量子光量子。光的能量。光的能量(E)决定决定于光的频率和波长：于光的频率和波长： cEhh 不同波长组成的光称为不同波长组成的光称为复合光复合光。(动画动画)白光白光(如日光如日光)是复合光，由是复合光，由380nm760nm 混合而成。混合而成。5四川农业大学四川农业大学15.1.2 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收溶液为什么有颜色，其实质是什么？实溶液为什么有颜色，其实质是什么？实验证明，溶液的颜色是验证明，溶液的颜色是由于均匀分布在溶液由于均匀分布在溶液中的中的有色化合物有色化合物的质点的质点选择性的吸收选

4、择性的吸收了某种了某种颜色的光所造成的颜色的光所造成的。 两种颜色的光若按适当比例混合，可两种颜色的光若按适当比例混合，可以形成白光，这两种光称为以形成白光，这两种光称为互补色光互补色光。光的互补光的互补6四川农业大学四川农业大学白光白光青蓝青蓝青青绿绿黄黄橙橙红红紫紫蓝蓝动画 如如KMnO4吸收吸收绿色光绿色光，因此，因此KMnO4溶溶液呈现液呈现紫色紫色。7四川农业大学四川农业大学15.1.3 吸收曲线吸收曲线 一束平行单色光照射溶液时，光的一一束平行单色光照射溶液时，光的一部分部分被吸收被吸收，一部分，一部分透过溶液透过溶液，一部分被器，一部分被器皿的表面皿的表面反射反射。IrItIaI

5、oIo = Ia + It + Ir8四川农业大学四川农业大学分光光度法中：分光光度法中： Io = Ia + It 在吸光光度法中，测定时都是采用在吸光光度法中，测定时都是采用同同样质量的比色皿样质量的比色皿，反射光的强度反射光的强度基本上是基本上是不变的，其影响可以不变的，其影响可以相互抵消相互抵消。 空白调零空白调零 透过光强度透过光强度It与入射光强度与入射光强度Io之比称为之比称为透透光度光度或或透光率透光率。用。用 T 表示：表示：9四川农业大学四川农业大学otIIT 或或%100%otIIT从上式可以看出：从上式可以看出：溶液的溶液的透光度愈大透光度愈大， 说明溶液对光的吸收愈小

6、，说明溶液对光的吸收愈小，浓度低浓度低；相反，相反，透光度愈小透光度愈小， 说明溶液对光的吸收愈大，说明溶液对光的吸收愈大，浓度高浓度高。 10四川农业大学四川农业大学吸光度吸光度A：TIIAto1lglg若光全部透过溶液，若光全部透过溶液，Io= It ， A = 0 。若光几乎全被吸收，若光几乎全被吸收，It 0， A = 。 吸光度吸光度A也可以用来衡量溶液中吸光物也可以用来衡量溶液中吸光物质对波长为质对波长为的单色光的吸收程度，的单色光的吸收程度，值越大值越大，其吸收程度越大，其吸收程度越大，透光率越小透光率越小；反之亦然；反之亦然11四川农业大学四川农业大学 将将不同波长的光不同波长

7、的光透过透过某一固定的溶液某一固定的溶液，测量，测量不同波长不同波长下溶液对光的下溶液对光的吸光度吸光度，作图，作图，图图15-2400480560640720 nm0.40.81.21.6AKMnO4 溶液的吸收曲线溶液的吸收曲线DCBA A、B、C、D代表不代表不同浓度下的吸收曲线。同浓度下的吸收曲线。12四川农业大学四川农业大学(1)同一种物质对不同波长光的吸光度不同。同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长最大吸收波长max。(KMnO4的的 最大最大 = 525 nm) (2)不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形不同浓度的同一

8、种物质，其吸收曲线形状相似状相似max不变。而对于不同物质，它们的不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线吸收曲线形状形状和和max则不同。则不同。可作为物质定可作为物质定性分析的依据之一。性分析的依据之一。吸收曲线的讨论吸收曲线的讨论13四川农业大学四川农业大学(3)不同浓度的同一种物质，在某一定波长不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度下吸光度 A 有差异，有差异，A 随浓度的增大而增随浓度的增大而增大大 。此特性可作为物质。此特性可作为物质定量分析定量分析的依据。的依据。(4)在在max处处吸光度随浓度变化的幅度最吸光度随浓度变化的幅度最大大，所以，所以测定最灵敏测定最灵敏。吸收曲线是定

9、量分析。吸收曲线是定量分析中选择中选择入射光波长的重要依据。入射光波长的重要依据。14四川农业大学四川农业大学15.1.4 吸光光度法的特点：吸光光度法的特点：1、灵敏度高，下限为、灵敏度高，下限为10-510-6 molL-1。适。适于微量分析。于微量分析。2、准确度较高，相对误差为、准确度较高，相对误差为2% 5%。3、操作快速简便，易于掌握。、操作快速简便，易于掌握。4、应用广泛。、应用广泛。15四川农业大学四川农业大学15.2 溶液对光的吸收定律溶液对光的吸收定律 实验证明：若保持入射光的波长不变，实验证明：若保持入射光的波长不变，溶液对光吸收的程度与溶液对光吸收的程度与溶液的浓度、液

10、层厚溶液的浓度、液层厚度度有关。有关。15.2.1 溶液对光的吸收定律溶液对光的吸收定律一、朗伯定律一、朗伯定律：当：当 、c、T 一定时，溶液一定时，溶液的的吸光度吸光度与液层的与液层的厚度厚度成正比。成正比。动画动画16四川农业大学四川农业大学数学表达式：数学表达式：bKA1K1：比例常数，：比例常数，与与 、c、T有关。有关。b：溶液厚度：溶液厚度二、比尔定律二、比尔定律比尔定律比尔定律：当当 、b 和和 T一定时，溶液的一定时，溶液的吸吸光度光度与溶液的与溶液的浓度浓度成正比。成正比。动画动画数学表达式：数学表达式： A = K2 c17四川农业大学四川农业大学三、朗伯三、朗伯比尔定律

11、比尔定律(同时考虑溶液浓度和同时考虑溶液浓度和液层厚度的影响液层厚度的影响)一束平行单色光通过溶一束平行单色光通过溶液，当液，当 和和T一定时，其一定时，其吸光度吸光度与与溶液的溶液的浓度浓度和和液层厚度液层厚度成正比。成正比。数学表达式数学表达式： A = K b c适应范围广。适应范围广。18四川农业大学四川农业大学 当当c用用gL-1表示，表示，b用用cm表示时，表示时，K用用a表表示，称为示，称为吸光系数吸光系数，其单位为，其单位为 L(g.cm)-1 ，则：则：四、比例系数四、比例系数K1、吸光系数、吸光系数aA = a b c a是吸光物质在一定的条件下的特性常是吸光物质在一定的条

12、件下的特性常数，数，与本性有关，与吸光物质的浓度和液与本性有关，与吸光物质的浓度和液层厚度无关层厚度无关。19四川农业大学四川农业大学 c用用molL-1表示，表示，b用用cm表示时，表示时，K用用表表示，称为摩尔吸光系数，其单位为示，称为摩尔吸光系数，其单位为L(mol.cm)-1。则：。则：2、摩尔吸光系数、摩尔吸光系数A =b c摩尔吸光系数的讨论(1) 是吸收物质在一定波长和溶剂条件下的是吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，不随浓度特征常数，不随浓度c和液层厚度和液层厚度b的改变而的改变而改变改变，仅与吸收物质本身的性质有关；，仅与吸收物质本身的性质有关；20四川农业大学四川农业

13、大学(2)同一吸光物质在不同波长下的同一吸光物质在不同波长下的值是不同值是不同的。的。在最大吸收波长在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数处的摩尔吸光系数，常以，常以max表示，表明该表示，表明该吸收物质最大限度吸收物质最大限度的吸光能力的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。能达到的最大灵敏度。 (3)max越大表明该物质的吸光能力越强，用越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。光度法测定该物质的灵敏度越高。21四川农业大学四川农业大学(4)在数值上等于浓度为在数值上等于浓度为1molL-1、液层厚度、液层厚度为为1cm时该溶

14、液在某一波长下的吸光度。时该溶液在某一波长下的吸光度。 104反应灵敏度反应灵敏度低低104 5104反应灵敏度反应灵敏度中中5104 105反应灵敏度反应灵敏度超高超高当当 c = 1molL-1，b = 1cm 时时, A =22四川农业大学四川农业大学【例】【例】：有一浓度为：有一浓度为1.0 g/ml Fe2+的溶液，以的溶液，以邻二氮菲邻二氮菲显色后显色后，在比色皿厚度为在比色皿厚度为 2cm、波长、波长510nm处测得吸光度为处测得吸光度为0.380，计算，计算( 1 )透光度透光度T；(2)吸光系数吸光系数a；(3)摩尔吸光系数摩尔吸光系数 。解解(1)T10-A10-0.380

15、0.417 (2)(3)1123109 . 1100 . 10 . 2380. 0 cmgLbcAa1143101 . 185.55100 . 10 . 2380. 0 cmmolLbcA 23四川农业大学四川农业大学NN3Fe2+NNFeNNNN+2+24四川农业大学四川农业大学注意：注意：因为因为cbIITAto lg1lg 在吸光光度在吸光光度法中，法中，b是一定的，是一定的， A与与c成正比，但成正比，但T 不与不与 c成正比。成正比。25四川农业大学四川农业大学五、吸光度的加合性五、吸光度的加合性A总总 = Ai =1b1c1 + 2b2c2 + nbncn 总的吸光度等于各个吸光物

16、质的吸光总的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。度之和。或或溶液的吸光度应等于溶液中各溶液的吸光度应等于溶液中各组分的吸光度之和。组分的吸光度之和。(组分间没有干扰组分间没有干扰)A4 A3 A2 A126四川农业大学四川农业大学溶液中多组分测定溶液中多组分测定)()()()()()()()(222111ybcyxbcxAybcyxbcxA 27四川农业大学四川农业大学 一、一、 1、单色光不纯，导致负偏差。、单色光不纯，导致负偏差。cA标准工作曲线图标准工作曲线图正误差正误差负误差负误差2、散射光的影响，胶、散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液由体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度于散射的

17、作用使吸光度增大，或入射光不是垂增大，或入射光不是垂直通过比色皿产生正偏直通过比色皿产生正偏差。差。28四川农业大学四川农业大学1、吸光质点的相互作用，浓度较大时，产、吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生负偏差，生负偏差， (c 12 Fe(OH)3棕橙色棕橙色 沉淀沉淀黄色黄色紫红色紫红色，既要防止被测离子生成沉淀，既要防止被测离子生成沉淀，又需防止有色配合物离解。又需防止有色配合物离解。有效的方法有效的方法是加入缓冲溶液是加入缓冲溶液(考虑干扰考虑干扰)磺基水杨酸37四川农业大学四川农业大学，有机溶剂会降低有色物的离解度，有机溶剂会降低有色物的离解度，从而提高从而提高 显色反应的灵敏度。显

18、色反应的灵敏度。 ，使干扰离子不显色。，使干扰离子不显色。，通过实验找出适宜的温度范围。，通过实验找出适宜的温度范围。，在颜色稳定的时间范围内进行比，在颜色稳定的时间范围内进行比色测定。色测定。38四川农业大学四川农业大学 ，测，测Ni2+时，时，Fe2+ 有有干扰，加入氧化剂，干扰，加入氧化剂， Fe2+ Fe3+ . ，用萃取、沉淀、电解、离，用萃取、沉淀、电解、离子交换等方法。子交换等方法。还可选择还可选择和和等方法来消除共存离子的干扰。等方法来消除共存离子的干扰。 ，如用，如用SCN-测定测定Co2+时，时，Fe3+有干扰，加入有干扰，加入 F- ，Fe3+ + 6F- = FeF63

19、- ， Fe3+ 被掩蔽。被掩蔽。 39四川农业大学四川农业大学 离子交换法用于离子交换法用于Fe3+、Al3+分离时先分离时先用用HCl溶液处理试液，使铁、铝分别以溶液处理试液，使铁、铝分别以FeCl63-、Al3+形态存在。然后经过形态存在。然后经过阳离子树阳离子树脂脂交换柱，此时交换柱，此时Al3+留在柱上，而留在柱上，而FeCl63-流流出柱子，从而达到分离的目的。出柱子，从而达到分离的目的。40四川农业大学四川农业大学 色谱分离法，若在充填硅胶、活性氧色谱分离法，若在充填硅胶、活性氧化铝、纤维素等载体的柱子上进行，则称化铝、纤维素等载体的柱子上进行，则称为为柱上色谱分离法柱上色谱分离

20、法；若用滤纸作载体，则；若用滤纸作载体，则称为称为纸上色谱分离法纸上色谱分离法。 溶剂化合物溶剂化合物萃取体系，例如萃取体系，例如磷酸三丁酯磷酸三丁酯萃取萃取FeCl3。 某些无机化合物某些无机化合物萃取体系，例如萃取体系，例如CCl4萃萃取取I2。41四川农业大学四川农业大学 钼酸铵法钼酸铵法(测测 P、 Si、W)， 过氧化氢法过氧化氢法(测测V5、Ti4)(主要使用主要使用) 铬天菁铬天菁S(CAS)、苯基荧光酮、苯基荧光酮( PF )偶氮胂偶氮胂III等等42四川农业大学四川农业大学：邻二氮杂菲邻二氮杂菲(测测Fe)等等4、带含硫基团的螯合剂：、带含硫基团的螯合剂：双硫腙双硫腙(测测C

21、u、Pb、Zn、Cd、Hg等等)43四川农业大学四川农业大学15.5.1、选择合适波长的入射光、选择合适波长的入射光 例测例测KMnO4，选选 最大最大 = 525 nm。但。但在有在有K2Cr2O7存在时，则应存在时，则应选选 = 545nm。44四川农业大学四川农业大学原则：使溶液的吸光度能真正反映待测物原则：使溶液的吸光度能真正反映待测物的浓度。的浓度。 在吸光度测量中，作为比较的溶液或溶在吸光度测量中，作为比较的溶液或溶剂称为剂称为参比溶液参比溶液或或空白溶液空白溶液。15.5.2选择适当的参比溶液。选择适当的参比溶液。45四川农业大学四川农业大学(1) 试样、试剂、显色剂试样、试剂、

22、显色剂都无色都无色时，用时，用。 (2) 试样无色试样无色，试剂、显色剂有色试剂、显色剂有色，采用，采用。(3)试样有吸收试样有吸收，而，而显色剂等无色显色剂等无色，可采用，可采用不加显色剂的试样为参比。不加显色剂的试样为参比。(4)均有色均有色，有吸收，对试样加入掩蔽剂，有吸收，对试样加入掩蔽剂，褪色后再加显色剂等作为参比。褪色后再加显色剂等作为参比。46四川农业大学四川农业大学15.5.3 吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择 透光率读数的准确度是仪器精度的主透光率读数的准确度是仪器精度的主要指标。测定结果的精度常用浓度的相对要指标。测定结果的精度常用浓度的相对误差误差dc/c表示。表

23、示。bcTA lgbdcdTT.Tlnd.Tlgd 434043400.434lgdcddATTTAc47四川农业大学四川农业大学若透光率刻度的读数的若透光率刻度的读数的绝对误差绝对误差为为T=1%，用不同的用不同的T代入上式，可得相应浓度测量代入上式，可得相应浓度测量的相对误差的相对误差c/c，作图，作图，0.434lgccTTT由图可见：由图可见：48四川农业大学四川农业大学1、T 在在15%65%(A= 0.80.2)范围，相对范围，相对误差较小。误差较小。2、T = 36.8%(A =0.434)，相对误差最小。，相对误差最小。(%)cc 0.20.40.60.81.00246810T

24、0.36849四川农业大学四川农业大学控制吸光度在适宜的范围内控制吸光度在适宜的范围内 (1) 控制试样的量或溶液的稀释程度来控制试样的量或溶液的稀释程度来控控制溶液浓度制溶液浓度。 (2) 选择选择不同厚度不同厚度的比色皿。的比色皿。50四川农业大学四川农业大学【例【例】某一有色溶液在某一有色溶液在2.0cm的吸收皿中，的吸收皿中，测得透光率测得透光率T1，若仪器透光度的绝对误，若仪器透光度的绝对误差差T0.5，计算，计算(1)测定的浓度的相对误差测定的浓度的相对误差c/c(2)为使测得吸光度在最适读数范围内，溶为使测得吸光度在最适读数范围内，溶液应稀释或浓缩多少倍？液应稀释或浓缩多少倍？(

25、3)若浓度不变，而改变比色皿厚度若浓度不变，而改变比色皿厚度(0.5cm， 1.0cm，2.0cm，3.0cm)，则应选择那种厚度，则应选择那种厚度的吸收皿最合适，此时的吸收皿最合适，此时c/c为多少？为多少？51四川农业大学四川农业大学解解 (1)%.lg.%.TlgTT.cc110100105043404340 (2)A=-lgT=-lg1%=2设有色溶液原始浓度为设有色溶液原始浓度为c，当，当b一定时，一定时，AbcK c，要使，要使A0.20.8，则，则80.20.8 221020ccccc即稀释即稀释2.510倍倍52四川农业大学四川农业大学 (3)当当c一定时即一定时即c，AbcK

26、 b，要使，要使A0.20.8，则，则80.20.8 221020bbbbbb=2cm 0.20.8 bb=0.5cm%.lg.%.TlgTT.cc41316031605043404340 -0.50.520.5 100.3162.0AT53四川农业大学四川农业大学1、目视比色法：、目视比色法：用眼睛比较溶液颜色深浅用眼睛比较溶液颜色深浅以确定物质含量。以确定物质含量。(也叫也叫标准色阶法标准色阶法)1 2 3 4 5 标准系列溶液标准系列溶液待测溶液待测溶液54四川农业大学四川农业大学目视比色法的原理是根据朗伯目视比色法的原理是根据朗伯比耳定律比耳定律 222111cbcb 相同条件下显色且

27、是同一种有色物质相同条件下显色且是同一种有色物质，所以：，所以：21因为液层厚度相等：因为液层厚度相等：b1=b2，所以浓度相等：所以浓度相等：c1=c2 55四川农业大学四川农业大学目视比色法的目视比色法的是：是：1、仪器简单，操作简便，适宜于大批试样、仪器简单，操作简便，适宜于大批试样分析。分析。2、测定的灵敏度较高，适宜于稀溶液中微、测定的灵敏度较高，适宜于稀溶液中微量元素的测定。量元素的测定。3、复合光、复合光 白光下进行测定，因此有白光下进行测定，因此有些显色反应不符合朗伯些显色反应不符合朗伯比耳定律时比耳定律时，仍可用目视法测定。，仍可用目视法测定。56四川农业大学四川农业大学目视

28、比色法的目视比色法的缺点缺点是：是：1、有色溶液一般不太稳定，常常临时配制、有色溶液一般不太稳定，常常临时配制一套标准色阶，较麻烦费时。一套标准色阶，较麻烦费时。2、依靠人的眼睛来观察颜色深度，有主观、依靠人的眼睛来观察颜色深度，有主观误差，准确度不高，相对误差约为误差，准确度不高，相对误差约为520%。 57四川农业大学四川农业大学铵的比色测定铵的比色测定标准系列法：标准系列法：原理：铵的测定是利用原理：铵的测定是利用NH4+与奈氏试剂与奈氏试剂(K2HgI4)作用，生成棕黄色溶胶。作用，生成棕黄色溶胶。 HgNH4+ + 2HgI42- + 4OH- = O NH2I + 7I- +3H2

29、O Hg 溶液的颜色深浅与溶液的颜色深浅与NH4+浓度成正比。浓度成正比。碘化二汞基铵碘化二汞基铵(碘碘化氨基氧汞化氨基氧汞)58四川农业大学四川农业大学用分光能力强的用分光能力强的或或进行分进行分光，得到的光更近似于单色光，光，得到的光更近似于单色光，59四川农业大学四川农业大学 先配制先配制一系列一系列标准溶液标准溶液，在，在最大吸收波长最大吸收波长处，测出它们的吸光度，作图，同条件测处，测出它们的吸光度，作图，同条件测未未知液的吸光度知液的吸光度，从图中查出未知液的浓度。，从图中查出未知液的浓度。cA标准工作曲线图标准工作曲线图Axcxc1c2c3c4c5A1A2A3A4A560四川农业

30、大学四川农业大学cA标准工作曲线图标准工作曲线图同学们在制作标同学们在制作标准曲线时有如下准曲线时有如下几种情况：几种情况： cA标准工作曲线图标准工作曲线图cA标准工作曲线图标准工作曲线图61四川农业大学四川农业大学 同条件下分别测定未知液与标准溶液同条件下分别测定未知液与标准溶液的吸光度的吸光度和和，根据朗伯，根据朗伯-比尔定律，应比尔定律，应有下式：有下式：xxcbA标标cbA标标ccAAxx/因为：因为：所以：所以：标标cAAcxx62四川农业大学四川农业大学例例：将：将1.000g钢样用钢样用HNO3溶解，钢中的锰溶解，钢中的锰用用KIO4氧化成高锰酸钾，并稀释到氧化成高锰酸钾，并稀释到100.0mL，用，用1.00