生化实训琼脂糖凝胶电泳

1、琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 唐琳CONTENTS原理原理步骤步骤注意事项注意事项原理电泳电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电极移动，称为电泳电泳(electrophoresis, EP)。利用。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为称为电泳技术电泳技术。原理琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 用用琼脂糖琼脂糖作支持介质的一种电泳技术。作支持介质的一种电泳技术。琼脂糖琼脂糖 一种线性多聚物。在水中一般加热到一种线性多聚物。在水中一般加热到90以以上溶解，温度下降到上溶解，温度下降

2、到35-40时形成良好的半固体时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。原理 琼脂糖凝胶具有琼脂糖凝胶具有网络状结构网络状结构。原理物质物质：小于孔径的物质可以快速通过，而大于孔径：小于孔径的物质可以快速通过，而大于孔径的物质则会受到阻力。其结果是可以区分的物质则会受到阻力。其结果是可以区分不不同大小同大小的分子。的分子。浓度浓度：凝胶的：凝胶的浓度浓度不同，形成的孔径大小也就不同。不同，形成的孔径大小也就不同。 浓度越大，孔径越小。浓度越大，孔径越小。 琼脂糖凝胶电泳现主要应用于琼脂糖凝胶电泳现主要应用于核酸核酸研究中。研究

3、中。“分子筛效应分子筛效应”原理核酸核酸 由许多由许多核苷酸核苷酸聚合成的生物大分子化合物，一聚合成的生物大分子化合物，一个核苷酸分子是由一分子含氮的个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基碱基、一分子、一分子五碳五碳糖糖和一分子和一分子磷酸磷酸组成的。组成的。原理核酸的两性解离核酸的两性解离 核酸既含有呈酸性的磷酸基团，又含有呈弱碱核酸既含有呈酸性的磷酸基团，又含有呈弱碱性的碱基，故为性的碱基，故为两性电解质两性电解质，可发生两性解离。，可发生两性解离。 其解离状态随溶液的其解离状态随溶液的pH而改变。当核酸分子而改变。当核酸分子的酸性解离和碱性解离程度相等，所带的正电荷与的酸性解离和碱性解离程度相

4、等，所带的正电荷与负电荷相等，此时核酸溶液的负电荷相等，此时核酸溶液的pH就称为就称为等电点等电点（isoelectric point, 简称简称pI）。）。OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHOCMPpKa2=4.5-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOOCMPpKa3=6.4-pI =CMPpKa1+pKa22=0.8+4.52= 2.65OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHOCMPpKa1=0.80H+-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHHOCMP+H+原理胞嘧啶核苷酸胞嘧啶核苷酸(CMP)(CMP)的解离的解离 原理根据核酸的解离性质，用根据核酸

5、的解离性质，用中性或偏碱性中性或偏碱性的缓冲液的缓冲液使核酸解离成使核酸解离成阴离子阴离子，置于电场中便向阳极移动。，置于电场中便向阳极移动。DNA属于属于碱稳定性碱稳定性物质物质 核酸都带核酸都带负电负电，在电场中沿同一方向，在电场中沿同一方向移动，再利用移动，再利用“分子筛效应分子筛效应”，就可用，就可用电泳的方法将不同大小的核酸分离开来。电泳的方法将不同大小的核酸分离开来。CONTENTS原理原理步骤步骤注意事项注意事项步骤1.电泳缓冲液电泳缓冲液常见的核酸电泳缓冲液有：常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE等。一等。一般选取般选取TAE，配为，配为50 x浓度，用前需稀释为浓度

6、，用前需稀释为1x。作用：作用：缓冲液在电泳过程中的一个作用是缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的维持合适的pH。电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电导电性性，以利于核酸分子的迁移。，以利于核酸分子的迁移。电泳缓冲液还有一个组分是电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，目的是螯合，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防酶，此外还可防 止镁离子与核酸生成沉淀。止镁离子与核酸生成沉淀。步骤2.琼脂糖凝胶的制作琼脂糖凝胶的制作 分离不同大小的分离不同大小的DNA片段所用的片段所用的最适凝胶浓度最适凝胶浓度是不

7、是不同的，数据见下表。同的，数据见下表。 凝胶浓度（%）线性DNA长度（bp）0.51000300000.7800120001.0500100001.240070001.520030002.0502000步骤DNA样品为200-2000bp。用作配胶的溶液应与电泳缓冲液完全一致。注意：制胶过程中应加入注意：制胶过程中应加入EB（溴化乙锭）（溴化乙锭），是一种，是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的胺凝胶中的DNA。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导导致错配，可能具有高致癌性。注意做好防护措施。致错配，可

8、能具有高致癌性。注意做好防护措施。步骤步骤3.电泳电泳步骤（1）点样）点样 样品已制备，加入点样孔中。如有气泡，应样品已制备，加入点样孔中。如有气泡，应轻轻赶出。轻轻赶出。（2）电泳）电泳 确定正负极，接通电源开始电泳。样品中已加确定正负极，接通电源开始电泳。样品中已加入入loading buffer，可以指示样品的位置。，可以指示样品的位置。4.照胶、结果分析照胶、结果分析步骤 溴化乙锭用标准溴化乙锭用标准302nm 紫外光紫外光透射仪激发并透射仪激发并放射出橙红色信号，可用放射出橙红色信号，可用Polaroid 底片或带底片或带CCD 成像头的凝胶成像处理系统拍摄。成像头的凝胶成像处理系统拍摄。步骤CONTENTS原理原理步骤步骤注意